响应面法优化提取虎耳草总酚及其抑制五步蛇毒PLA2酶活性的相关性

孙彤彤 王忠娟 张秀娟 杨诗涵 陈小强，2 张 莹*

（1. 东北林业大学化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040；2. 西藏农牧学院资源与环境学院，林芝 860000）

虎耳草（）别名金线吊芙蓉、石荷叶、老虎耳等，为多年生常绿草本植物，是虎耳草科（）虎耳草属（）植物，世界上存在的虎耳草属植物大约有400 余种，常生长于海拔400～4 500 m 的灌丛、草甸以及潮湿岩缝等地，世界上多分布于南美洲、北极和北温带，在我国约有203 种，南北均产，主要产于青海、甘肃、江西等地。

虎耳草全草，是一种常见苗药，有“家庭药箱”之说，具有很高的药用价值，始见于《履巉岩本草》，曾收载于《中国药典》（一部）1977 年版和《上海市中药材标准》1994 年版等多本著作，其性微苦，辛，寒，且有祛风、清热和凉血解毒等功效，多用于治疗疟疾、丹毒、咳嗽吐血和湿疹等病症。现代药理学研究表明虎耳草具有抗炎、抑菌、保肝等多种药理活性。研究表明，虎耳草含有多种生物活性成分，包括黄酮类、有机酸、甾体类和多酚类化合物。虎耳草作为我国传统的民族药物，不仅产地来源多、方便采摘，在民间用于治疗蛇伤，效果明显，因此对苗药虎耳草的成分及其抑制蛇毒活性的原理进行研究，为蛇伤患者的治疗提供科学依据，具有深远意义。

超声波可产生的强烈空化效应能促使植物组织破壁，利用超声波辅助提取，使溶剂更好地渗透入植物的组织细胞，使中草药的有效成分提取得更充分，用时短且提取率较高，适用条件也更为广泛。因此本文采用超声辅助提取虎耳草TP，通过单因素分析，将粒径、料液比、超声功率和超声时间四个因素对虎耳草TP 含量及其对五步蛇（）毒PIR 的影响进行分析研究，利用响应面法优化提取参数，确定最佳提取工艺条件，并对虎耳草TP 含量及其对五步蛇毒PIR进行相关性分析，以期为虎耳草进一步的药理学研究提供试验基础，为虎耳草抗蛇毒制剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

虎耳草全草购于北京同仁堂；五步蛇毒购于皖南医学院蛇毒研究所；超纯水由Unique-R20 多功能超纯水系统制备；没食子酸（>98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为分析纯。

仪器：FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；FA114A 电子天平，上海奔普仪器科技有限公司；52N紫外-可见分光光度计，上海精科实业有限公司；JP-100ST 数控超声清洗机，深圳洁盟清洗设备有限公司；RE-52AA 旋转蒸发仪，上海青浦沪西仪器厂；HL-60 恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；H1650 离心机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 没食子酸标准曲线的绘制

采用福林—酚法绘制没食子酸（GA）标准曲线，以没食子酸质量浓度为横坐标（）、吸光度为纵坐标（）绘制标准曲线，利用752N 紫外—可见分光光度计，测定吸光度，可得没食子酸标准溶液在质量浓度0.03～0.50 g·L内与吸光度的线性关系较好，拟合线性方程为=4.324 3+0.149 3（=0.997 8）。

1.2.2 虎耳草总酚（TP）提取单因素试验

将室温条件下干燥至恒质量的虎耳草粉末过筛，分别研究粒径、料液比、超声功率、超声时间对虎耳草TP含量和其五步蛇毒PIR的影响。试验范围分别为：粒径：20、40、60、80、100 目；料液比：1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80；超声功率：100、200、300、400、500 W；超声时间0.5、1、2、3、4 h。各做三组平行试验。虎耳草总酚的提取参照Habermann等的方法进行，并根据所绘制的没食子酸标准曲线计算虎耳草TP含量。

1.2.3 响应面优化试验

为确定虎耳草TP含量及其对五步蛇毒PIR的最佳条件，利用Design-Expert 软件（10.0.7 版）进行试验设计，以虎耳草TP 含量和PIR 作为响应值进行试验，并采用Box-Behnken 方法将所得结果进行回归和优化。

1.2.4 虎耳草水提物抑制五步蛇毒PLA活性测定

根据Rojas 等的方法制备平板培养基。再将已经凝固的平板用直径为3 mm 的空心管进行打孔，每孔的间隔约45 mm，依次做好标记。

称取虎耳草水提物60 mg，加入超纯水500 mL充分溶解，将配制好的溶液依次稀释至0.12、0.10、0.08、0.06、0.04 g·L。分别将20µL上述不同质量浓度虎耳草提取物溶液与等体积1 mg·mL蛇毒混合，将混合液于37 ℃水浴锅中静置45 min 后5 000 r·min离心5 min（H1650 医用离心机，湘仪离心机仪器有限公司）。取上清液10µL依次加入平板培养基的孔中，以0.12 g·L虎耳草提取物溶液和1 g·L五步蛇毒分别作为阴性和阳性对照，在37 ℃恒温培育箱中进行8 h的培育，取出平板用游标卡尺测量并记录透明圈直径，计算出PIR（公式中表示为），混合液透明圈直径以表示，蛇毒透明圈直径以d表示，即：

1.2.5 最佳优化提取条件验证

根据单因素试验及响应面优化结果进行分析，得到虎耳草TP 含量和其对五步蛇毒PIR 的最佳提取条件，并对所得结果进行优化验证。

称取虎耳草粉末5 g，过筛（粒径60 目），以料液比1∶50 加水250 mL，浸泡2 h，在50 ℃下超声（250 W）提取1.8 h，进行过滤，将滤液于60 ℃旋转蒸发仪中浓缩至干，将所得虎耳草水提物配制为1 g·L的水溶液进行TP测定，做3次平行试验。

将上述试验操作下所得虎耳草水提物配制成0.12 g·L的溶液，在平板上打孔，取上述溶液20µL 加入1 g·L的蛇毒溶液20µL，操作同1.2.4，取出平板记录透明圈直径并计算出PIR，做3 次平行试验。

1.3 数据统计分析

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

如图1为单因素试验中，粒径、料液比、超声功率、超声时间4 个因素分别对虎耳草TP 含量和PIR的影响。

由图1a 可知，在粒径20～60 目的范围内，虎耳草TP 含量及PIR 随粒径的增大而增加，粒径为60目时TP 含量和PIR 最大，在粒径60～100 目的范围内，TP 含量和PIR 均呈下降趋势。由于粒径目数增大，虎耳草粉末间隙变小，溶剂渗透性降低，故导致提取物中TP 含量降低，PIR 下降，因此将粒径60目设定为最优。

图1 单因素试验结果Fig.1 Results of single factor experiments

由图1b 可知，在料液比1∶10～1∶40 范围内，随着料液比的提高，虎耳草TP含量及PIR随之增加。当料液比为1∶40 时，TP 含量和PIR 均为最大，在料液比1∶40～1∶80 范围内，TP 含量和PIR 增加幅度缓慢，逐渐平稳。当料液比为1∶10 时，虎耳草粉末与水接触不充分，细胞内外间浓度差过低导致提取物的传质效率不高，使TP含量和PIR较低；随着料液比增大，虎耳草粉末与水充分接触有利于多酚类化合物溶出，使TP含量和PIR逐渐增加；但料液比过大时，单位体积提取剂内TP 含量降低，被分散的多酚类化合物容易发生分解，造成原料浪费，从经济角度考虑，在后续试验中以料液比1∶40为最优条件。

由图1c可知，在超声功率100～300 W 内，虎耳草TP 含量及PIR 随超声功率的增大而增加，300 W 时TP 含量和PIR 均为最大，在超声功率300～500 W 内，TP 含量和PIR 均呈下降趋势。增加超声功率能在一定程度上提高传质效率，加速有效成分的溶出，但超声功率过大可能使多酚类成分遭到破坏，故使TP 含量降低，因此将最优超声功率条件设定为300 W。

由图1d 可知，在超声时间0.5～1 h 内，虎耳草TP 含量及其PIR 随着超声时间增加先下降，1h 之后逐渐上升，3 h 时TP 含量和PIR 均为最大，在超声时间3～4 h 内，TP 含量和PIR 逐渐下降，进行超声时，超声时间太短，活性成分并未完全溶出，所以导致TP 含量和PIR 较低，随着超声时间逐渐增加，多酚类物质能充分溶出，故使TP含量和PIR升高，但是超声时间过长，容易造成有效成分的分解，因此TP 含量和PIR 会降低，故将超声时间3 h设定为最优条件。

2.2 响应面法优化试验

2.2.1 方差与模型建立分析

根据单因素试验，将粒径（）、料液比（）、超声功率（）、超声时间（）作为考察因素，以虎耳草TP 含量和其对五步蛇毒PIR 为响应值，利用Design-Expert 10.0.7版软件设计四因素三水平Box-Behnken 响应面试验，将粒径、料液比、超声功率和超声时间四个因素值进行优化，得到虎耳草TP含量及其对五步蛇毒PIR的结果及标准差（见表1）。

表1 Box-Behnken 试验设计与结果Table 1 Box-Behnken design（BBD）experiment design and results

将表1所得的数据结果进行多元回归拟合，得到虎耳草TP 含量和其对五步蛇毒PIR（、）对四个因素的二次回归方程如下：

通过对值和值的分析可观察出回归方程各因素的显著性，来揭示各变量间的相互作用，<0.05 说明差异显著，<0.01 说明差异极显著Box-Behnken响应面试验结果方差分析见表2。

表2 回归模型的方差分析结果Table 2 Variance analysis results of regression model

由 表2 可 见，TP 含 量 和PIR 的值 分 别 为36.47 和12.88，<0.000 1，说明该模型有统计学意义；TP含量的失拟项为0.44，PIR失拟项为5.85，且>0.05，说明失拟项显著，建模成功；回归模型下，一次项（）对TP 含量影响极显著（<0.01），交互作用项（AD、BD）对PIR 影响显著（<0.05），二次项（、、、）对TP 含量影响效果非常明显（<0.01），对PIR 影响效果明显，其中A和C对PIR 具有极显著影响（<0.01），说明四因素对TP 含量和PIR 具有一定函数关系。在响应面试验范围内，通过对比四个因素的F 值，可知各因素对TP 含量的影响的主次排序为>>>，即粒径>料液比>超声时间>超声功率；各因素对PIR 影响的主次排序为>>>，即超声时间>粒径>超声功率>料液比。

TP 含量和PIR 回归方程的分别为0.97 和0.93，说明模型的拟合度较高，且决定系数Adj分别为0.95 和0.86，说明预测值与实测值相差较小，实用性较高。TP 含量和PIR 回归方程的变异系数（CV%）分别为2.55 和10.76，说明模型能较好的反映数据的真实性，TP 含量和PIR 的回归方程 的 信 噪 比（Adeq precision）分 别 为19.46 和13.24，说明具有充分的信号来响应模型。综上所述，该模型可靠性较高，可用于进行虎耳草TP 含量的提取和其对五步蛇毒PIR的分析。

2.2.2 三维响应面图分析

三维响应面图可以直观的表现出不同影响因素的交互作用对响应值的影响，可通过等高线来判定试验结果，如图2，各个因素及其交互作用对虎耳草TP 含量及其对五步蛇毒PIR 的影响，均为开口向下的凸形曲面，则说明TP 含量和PIR 均存在最大值。如图2a 和图2a1，当超声功率（）和超声时间（）分别为300 W 和2 h时，粒径（）和料液比（）对TP 含量和PIR 回归方程的线性和二次项均影响显著，且等高线图形状均近似椭圆形，说明两个因素的交互作用具有显著影响；如图2b 和图2b1，当料液比（）和超声时间（）分别为1∶40和2 h 时，随着超声功率和粒径的不断增加，TP 含量和PIR 均呈先增加后下降趋势，且等高线表现为近圆形，因此超声功率和粒径的交互作用均不明显；如图2c 和图2c1 可知，当料液比（）和超声功率（）分别为1∶40 和300 W 时，随着超声时间和粒径的增加，TP 含量和PIR 均呈先增加后下降趋势；且等高线表现为近似椭圆形，说明超声时间和粒径交互作用影响均为显著；如图2d 和图2d1，当粒径（）和超声时间（）分别为60 目和2 h 时，随着功率的不断增加，TP 含量和PIR 均呈先增加后下降的趋势，随着料液比的逐渐增加，TP含量呈先增加后下降的趋势，而PIR 则呈上升趋势，但等高线表现为椭圆形，说明超声功率和料液比的交互作用均为显著；如图2e 和图2e1，当粒径（）和超声功率（）分别为60 目和300 W 时，随着超声时间和料液比的不断增加，TP 含量呈先增加后下降的趋势，PIR 呈上升趋势，且等高线表现为近圆形，故超声时间和料液比交互作用影响均为不显著；如图2f 和图2f1，当粒径（）和料液比（）分别为60 目和1∶40 时，随着超声时间和超声功率的不断增加，TP 含量和PIR 均呈先增加后下降趋势；但等高线表现为椭圆形，说明超声时间和超声功率的交互作用影响均为显著。从单因素试验结果来看，随着料液比的增加，TP 含量和PIR 均呈增加趋势，与响应面试验结果略有不同，可能是由于粒径和超声功率或超声时间的交互作用导致。

图2 提取条件交互作用对TP含量（a、b、c、d、e、f）和PIR（a1、b1、c1、d1、e1、f1）影响的响应曲面图Fig.2 Extract the response surface plot of the influence of conditional interaction on TP content（a，b，c，d，e，f）and PIR（a1，b1，c1，d1，e1，f1）

2.3 最佳提取条件验证

利用Design-Expert 10.0.7 版软件优化的最佳提取条件为：粒径62.81 目，料液比1：49.23，超声功率252.06 W 和超声时间1.811 h，TP 含量和PIR的预测结果的最大值分别为87.6 mg·g和41.06%。以试验的操作可行性为基础，将预测的最佳条件进行简单修改，更改后的条件为粒径60目，料液比1：50，超声功率250 W 和超声时间1.8 h，进行三次平行试验，测得虎耳草TP 含量和其对五步蛇毒PIR 分别为（86.90±0.46）mg·g和（40.91±0.21）%，与预测值的误差较小，说明优化模型的预测结果精准可靠。

刘佳等通过单因素试验和Box-Behnken 响应面优化，对虎耳草中抗氧化活性物质提取最佳试验条件进行确定，再将优化条件下获得的提取液进行多项成分分析（总黄酮、总多酚、多糖），其中获得TP含量为20.27 mg·g，从上述试验及分析中，可得该方法获得总酚含量较高，但是只能说明当抗氧化活性较高时各成分的交互作用，不能精确说明TP 含量的最佳条件和结果，因此本文在综合考虑下，以虎耳草水提物为指标，进行TP 测定，对TP 含量的优化条件更加准确，具有科学性依据。

2.4 虎耳草水提物中TP 含量及其对五步蛇毒PIR相关性

利用响应面试验所得结果进行优化，所得TP含量和PIR 的优化范围分别为64.4～87.6 mg·g和21.7%～41.06%，在此范围下探索TP 含量及其对五步蛇毒PIR 的相关性（见图3），在试验范围内，随着TP含量的增加，对五步蛇毒PIR逐渐增大，呈正相关，应用SPSS20.0 版本软件进行相关性分析可得，Pearson 相关系数为0.958（<0.01），说明虎耳草TP含量与PIR极显著相关。

图3 虎耳草TP含量和其对五步蛇毒PIR的相关性Fig.3 Correlation between TP content in the aqueous extract of S. stolonifera and PIR in D. acutus venom

熊艳等利用小叶三点金不同萃取相对尖吻蝮蛇毒主要酶类的抑制进行研究，并通过GCMS 分析，从乙酸乙酯萃取相中共检测出26 种成分，发现其中含有大量具有抑制蛇毒活性的总酚类成分，能够有效地抑制蛇毒PLA酶的活性；和七一等采用中草药徐长卿进行毒蛇咬伤的分子机制研究，采用有机溶剂萃取、柱层析及高效液相色谱法（HPLC）相结合，从徐长卿中筛选并筛选出主要活性成分，经质谱和核磁共振鉴定为丹皮酚原苷。采用分子模拟软件技术，揭示出丹皮酚原苷是通过与蛇毒中主要成分金属蛋白酶和PLA发生相互作用，从而抑制尖吻蝮蛇毒发挥致伤作用；因此通过相关文献可知，TP 含量可能是抑制五步蛇毒中PLA活性的影响因素。

3 结论

在单因素试验基础上，筛选出粒径、料液比、超声功率和超声时间的四因素三水平取值，利用Box-Bohnken Design 原理设计试验，结果表明，虎耳草TP 及PIR 的最佳提取工艺条件为：粒径60目，料液比1∶50，超声功率250 W 和超声时间1.8 h，根据优化条件测定虎耳草TP含量及PIR分别为（86.90±0.46）mg·g和（40.91±0.21）%，与预测值误差均小于1.5%，说明模型精准可靠。相关性分析结果表明，虎耳草TP 含量及其对五步蛇毒PIR呈极显著正相关，因此TP 应是抑制五步蛇毒中PLA活性的物质基础，该结果为虎耳草后续的药理学研究与应用开发提供了一定的理论依据。