糖尿病视网膜病变伴糖尿病肾病患者转录组学差异分析

陈建斌 刘颖 张华北 李志琛 何徐军 梅伟群 钱佳丽 欧阳建

糖尿病视网膜病变（DR）和糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）常见的微血管并发症。随着全球糖尿病患病率的增加，DR和DN引起的视力丧失及肾功能衰竭严重危害患者的健康甚至生命。DM患者中，DR和DN同时或先后发生的比例较高，表明两者可能存在共同的发病机制。本研究采用转录基因组测序技术检测入组患者外周血白细胞，从中筛选DR伴DN差异表达基因，为进一步明确DR伴DN易感基因提供候选基因。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年2月至10月联勤保障部队第903医院T2DM患者14例，其中6例不伴DN和DR纳入DM组，8例伴DR和DN纳入DNDR组。入选患者均符合1999年WHO糖尿病诊断标准［1］。DM组纳入标准：眼底照相除外DR，ACR＜30 mg/g。DNDR组纳入标准：①依据2002年DR国际分期标准［2］。双眼眼底彩色照相检查符合中度以上非增殖性DR（NPDR）或增殖性DR（PDR）；②依据2012年ADA筛查和诊断标准。即时尿标本的白蛋白/肌酐（ACR）＞30 mg/gCr，且3个月内监测3次ACR至少有2次升高。排除标准：①T1DM、妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病；②闭角型青光眼及葡萄膜炎患者；③除DR外的其他视网膜疾病；④高血压、冠心病、慢性阻塞性肺病、恶性肿瘤、脑卒中；⑤剧烈运动、发热、尿路感染、肾病综合征等其他原因导致ACR升高。两组患者糖化血红蛋白水平、病程、年龄差异均无统计学意义。本项目经联勤保障部队第903医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）主要试剂及仪器：北京爱普华美生物科技有限公司对每份外周血白细胞样本进行RNA抽提、文库构建和质检，华大基因公司对转录组文库进行测序和数据质控。采用荧光定量PCR技术检测蛋白激酶C delta结合蛋白（PRKCDBP）基因、CD177抗原（CD177）基因的mRNA表达。RNase OUT™（5,000 U）（10777-019）、5X第一链缓冲液（18064-015）、5X第二链缓冲液（10812-014）、SuperScript III逆转录试剂盒（18064-014）、Trizol（15596026）、Dynabeads mRNA 纯化试剂盒（610-06）、苯酚/氯仿/异戊醇（15593-31）购自美国Invitrogen公司；Phusion DNA聚合酶（F-531L）、外切核酸酶1（M0293S）、DNA连接酶（M2200L）均购自美国NEB公司；红细胞裂解液（批号RT122-02Lot//N2214）购于杭州开泰生物技术有限公司；dNTPs混合物（BF7801A）、荧光定量PCR试剂盒TB Green®Premix Ex Taq™ II（TliRNaseH Plus）购自日本TaKaRa公司；GAPDH引物、CD177、PRKCDBP均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。PTC-100型PCR仪购自美国BIO-RAD公司；凝胶成像系统（Tanon）购自上海天能科技有限公司；紫外线分光光度仪（nanodrop1000）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；安捷伦2100生物分析仪购自美国Agilent公司。（2）白细胞分离：空腹采集患者外周血，加入装有抗凝剂（乙二胺四乙酸二钾，EDTA-K2）的血常规管中。离心后沉淀部分加入红细胞裂解液，期间再颠倒混匀几次，沉淀中加入1 mL Trizol试剂，分离后的白细胞分装，放置冰箱保存。（3）RNA提取、反转录和转录组测序：采用RNA提取试剂盒提取总RNA，nanodropRNA质检和安捷伦2100生物分析仪检测RNA完整度，然后进行测序。（4）转录组测序数据的过滤和评估：由Illumina HiSeq TM 2000测序所得的数据为raw reads。通过软件得到clean reads，并进行质控。（5）基因表达注释和定量：将clean reads比对到参考基因组和参考基因序列，统计其分布情况及覆盖度。利用每个碱基长度reads数计算基因表达量。（6）GO以及Pathway显著性富集分析：基因本体（GO）包括3个本体：分别描述参与的生物过程GO-P、所处的细胞位置GO-C、分子功能GO-F。应用超几何检验，再通过富集分析确定差异基因的主要生物学功能。通过生化代谢与信号转导通路（Pathway）显著性富集分析确定差异基因参与的主要生化代谢和信号转导途径。（7）基因相互作用网络分析：对差异表达基因、直接相互作用的基因进行基因互作网络分析。（8）RT-qPCR验证：实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测PRKCDBP、CD177的mRNA相对表达量。同时绘制熔解曲线，采用2-ΔdΔCT法计算目的基因的相对表达量。引物序列如下：PRKCDBP-forward：5'-CACGTTCTGCTCTTCAAGGAG-3'，PRKCDBP-reverse：5'-TGTACCTTCTGCAATCCGGTG-3'；CD177-forward：5'- CGGCAATGGACCCCTAAGAAC-3'，CD177-reverse：5'- AACGAGGTTGTTGCAGAAGTC-3'；GAPDH-forward：5'- CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，GAPDHReverse：5'- AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。取DM及DNDR组基因表达量的均数（mean）和中位数（median），分别计算两组间各个基因相应的ratio值。差异表达基因的设定标准为mean和median倍数上下调均≥2.0倍。PRKCDBP和CD177mRNA表达量以（）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质控结果 nanodropRNA质检和安捷伦2100检测14份样本RNA质量均合格，采用RNA-seq和qPCR定量两种方法对转录组文库质检均合格。全部样本数据过滤后Q20比例均＞93.9%，GC含量为46.61%～49.15%，clean reads比例平均占raw reads的＞97%，测序数据良好。reads在基因覆盖度以及参考序列上的分布情况均合格，可用于后续分析。

2.2 差异表达基因 与DM组比较，DNDR组所筛选出的差异表达基因98个，上调42个，下调56个。见表1。

表1 DRDN与DM组比较差异表达基因

2.3 GO注释和富集分析结果 见图1。

图1 差异基因本体分析

2.4 Pathway显著性富集分析 差异表达基因参与77条Pathway（图2结果显示富集到差异基因最多的前20条Pathway），其中最显著的为移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮以及抗原处理和递呈。上调最明显的ABHD11反义 RNA 1（ABHD11 antisense RNA 1，ABHD11-AS1）未富集到相关Pathway，下调最明显的丝氨酸肽酶抑制剂Kazal 4前体（SPINK4）参与ECM-受体相互作用（ECM-receptor interaction）Pathway。

图2 前20 pathway富集分析图

2.5 差异基因相互作用网络分析 差异基因对应的蛋白相互作用网络，PDZ结合激酶（PBK）与蛋白激酶C delta结合蛋白（PRKCDBP）、Ras关联域家族成员6（RASSF6）相互作用。KIR2DL1与KIR2DS1存在相互作用。见图3。

图3 基因相互作用网络分析图

2.6 PRKCDBP和CD177mRNA表达RT-qPCR检测结果 DNDR组PRKCDBPmRNA表达量低于DM组，DNDR组CD177的mRNA表达量高于DM组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 2组PRKCDBP和CD177 mRNA表达比较

3 讨论

糖尿病发病率逐年升高，严重威胁人类健康，我国约20%～40%的DM患者合并DN［3］，而糖尿病患者中约有1/3 出现糖尿病视网膜病变症状［4］。研究发现，严格控制血糖可降低DR和DN的发生风险，但不能完全阻止其发生和进展［5］。临床观察显示，部分DM患者持续高血糖但不发生微血管并发症，而部分DM患者病程较短，血糖控制良好，却发生严重的DR和DN。在单卵双生双胞胎中，DR和DN的患病率一致［6］，表明遗传因素在DR和DN发病中具有重要作用。

本研究共筛选出98个DNDR差异表达基因，为进一步验证DRDN易感基因提供了候选基因。差异基因相互作用网络分析显示多个差异基因之间存在相互作用，富集性分析发现一个基因可以参与多个GO或Pathway，也可以多个基因参与一个GO或Pathway，表明DNDR发生发展是多基因相互作用的结果。

KIR2DL1、KIR2DS1通过自然杀伤细胞介导的细胞毒性调节NK细胞活性，在抗原处理与提呈过程中发挥作用。有文献报道，活化的KIR2DS1受体与自身免疫性疾病［7］，病毒感染的控制［8］、恶性肿瘤［9］等有关。KIR2DL1是NK细胞表面主要的抑制性因子，PARHAM等［10］发现，KIR2DL1识别KG1A细胞株表面HLA-C2表型，可抑制NK细胞对KG1A细胞的杀伤活性。KIR2DL1作为NK细胞表面主要的抑制性因子，在各种恶性肿瘤免疫效应中发挥重要作用。SHASTRY等［11］研究发现，KIRs与糖尿病易感性相关且存在种族差异。在拉脱维亚成人患者中，KIRs 2DL1、2DS2和2DS4是易感因子，2DS5是保护因子；而在印度成人患者中，KIRs 2DL5和3DL1是易感因子，2DS1和2DS3是保护因子。本研究中DNDR组KIR2DL1、KIR2DS1下调，KIR2DL1、KIR2DS1与DR伴DN之间的关系仍需进一步验证。

文献报道，上调最明显的ABHD11-AS1基因主要与肿瘤有关［12-13］，下调最明显的丝氨酸肽酶抑制剂Kazal 4型（SPINK4）参与ECM-受体相互作用（ECM-receptor interaction）的Pathhway SPINK4在乳糜泻（CD）患者中显示差异基因表达，在未治疗患者中最高，在无谷蛋白饮食开始时急剧下降，与CD病理改变相关的差异基因表达，可能来自杯状细胞活性的改变［14］。PIETZ等［15］发现活动性CD的肠上皮细胞中SPINK4显著上调，活动性CD中，SPINK4和抗微生物凝集素1（ITLN1）的表达水平的显著增加表明对细菌的先天免疫。研究揭示下调最明显的SPINK4与炎症过程有关，而在DNDR发病机制中的作用仍待深入研究。

PRKCDBP，又称为细胞膜穴样内陷相关蛋白3（CAVIN3），通过CAVIN1靶向细胞膜穴样内陷，与窖蛋白1（caveolin1）的支架结构域相互作用并促进细胞膜穴样内陷动力学［16］，CAVIN3缺失减少平滑肌中细胞膜穴样内陷的数量，且部分使CAVIN1不稳定，使血管对一氧化氮的敏感性升高，在严重细胞应激的情况下干扰高尔基体内稳态。ZHU等［17］研究发现，CAVIN3有助于体内平滑肌中细胞膜穴样内陷的形成。CAVIN3消融使平滑肌细胞中细胞膜穴样内陷的密度降低40%～45%，而内皮细胞保持细胞膜穴样内陷丰度。PRKCDBP是一种推定的肿瘤抑制因子，已经在几种癌症中观察到改变［18］，也有研究发现与溃疡性结肠炎（UC）有关，PRKCDBP被鉴定为响应肿瘤坏死因子（TNF）-α而被核因子-κB激活。PRKCDBP的黏膜表达与UC患者中的TNF-α表达强烈相关，且IFX治疗导致PRKCDBP和TNF-α的显著降低。因此，这些发现支持PRKCDBP表达受TNF-α严格控制，且IFX的抗炎作用可能部分源于阻断TNF-αPRKCDBP信号传导途径［19］。本研究中PRKCDBP明显下调，其对DR、DN的影响是否与血管平滑肌内陷或炎症作用有关需进一步研究。

编码分泌信号蛋白结构的相关基因组成了WNT基因家族。WNT3通过激活WNT-β-catenin信号通路参与肿瘤发生，WANG等［20］发现胃癌中的WNT3表达显著升高，表明上调的WNT3可以通过诱导癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并通过抑制癌细胞的凋亡在胃肿瘤发生中起关键作用。研究发现［21］WNT3可通过WNT3α/β-catenin信号通路影响足细胞，可能与肾病有关。ZHOU等［22］报道，WNT信号通路在年龄相关性黄斑变性和DR动物模型的视网膜和视网膜色素上皮细胞中被激活，诱导血管生成和炎症因子的过量产生。另一方面，由经典WNT途径的激活诱导ROS产生可能通过NF-B途径促成炎性因子的过表达，反过来炎性因子的过度表达加剧炎症的发展，经典WNT途径的激活诱导视网膜炎症和氧化应激，在DR中发挥致病作用，本研究中WNT3上调，上述机制是否参与其在DR、DN发病中的作用需进一步探讨。

CD177是由可变比例的人嗜中性粒细胞表达的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，其介导抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）抗原蛋白酶3的表达，D177与β2整联蛋白结合并识别血小板内皮细胞黏附分子［23］。在抗中性粒细胞胞浆抗体相关的系统性血管炎（AASV）患者中发现膜表达蛋白酶3（PR3）的增加依赖于CD177表达，并且与CD177基因的转录相关，中性粒细胞亚群向MPR3+/CD177+表型转变与成熟中性粒细胞过度产生CD177有关，表明CD177在中性粒细胞迁移中的作用。成熟的MPR3和CD177在包括AASV患者在内的所有个体的中性粒细胞质膜上共同表达。AASV和SLE患者的中性粒细胞中，MPR3+/CD177+表型以及PR3和CD177的mRNA表达增加［24］，以上研究表明CD177与炎症有关。本研究中DNDR组CD177表达上调，其在DR、DN发病中的作用是否与其致炎症作用有关，需进一步证实。