基于电子舌技术的生 炒酸枣仁滋味比较

李虹，黄晓欣，刘勇，田卉玄，王泽亿，王宇航

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

酸枣仁为鼠李科枣属多年生落叶灌木或小乔木植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子。其味甘、酸，性平，归肝、胆、心经，可以养心补肝、宁心安神、敛汗，临床常用于治疗虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴[1]，始载于《神农本草经》，列为上品，是养心益肝安神的首选药[2-3]。

中药有“逢子必炒”炮制理论，酸枣仁作为典型的种子类药材，有“生熟异治”用药之说，其主要炮制品为炒酸枣仁，有关生、炒酸枣仁差异的研究，现多从化学成分、药理作用展开。刘晓等[4]建立了生、炒酸枣仁水提液指纹图谱，在生酸枣仁中确定了10 个共有峰，在炒酸枣仁中确定了12 个共有峰。李振雨等[5]建立了生、炒酸枣仁70%甲醇提取液指纹图谱，在生酸枣仁中确定了17 个共有峰，在炒酸枣仁中确定了15 个共有峰。蔡瑾瑾等[6]对生、炒酸枣仁脂肪油成分分析表明，炒制对酸枣仁各成分相对质量分数均有影响。翟旭峰等[7]研究发现，酸枣仁炒制后，其镇静、催眠作用增强。吴巧敏等[8]研究发现，在改善大鼠学习和记忆能力方面，生酸枣仁优于炒酸枣仁。目前，有关酸枣仁炒制前后滋味变化的研究未见报道。中药药性理论是临证立法、组方配伍的重要依据[9]，其中，五味是中药药性理论的重点之一，药性理论中所提“辛、酸、甘、苦、咸”五味既可能是中药自身的味道，也是中药功效的高度概括[10]，不等同于中药本身的滋味。中药本身的味道多基于口尝获得，然而人工口尝主观性较强且个体差异大，难以对中药的滋味做出客观评价。

ASTREE 型电子舌是对传统分析技术的补充，能够对滋味和通常溶解在液体中的有机和无机复杂的样品进行分析，并对味道特征值进行判别[11]。电子舌技术又称味觉传感器技术，作为一种新兴的快速检测液体样本信息的仪器[12]，可以模拟人的味觉系统，能够克服主观因素对味觉信息判断的影响，具有操作简单、检测快速的优点。其主要应用于食品领域，如食醋[13]、酒精[14-15]、茶叶[16]等。近年来，在中药研究领域应用也较广泛，如中药产地鉴别[17]、真伪鉴别[18]、炮制前后差异比较[19]等。

本研究采用电子舌技术对生、炒酸枣仁各滋味进行测定，结合多元统计模式识别分析方法，探讨酸枣仁炒制前后其本身滋味的改变，并建立生、炒酸枣仁滋味判别模型，以期为生、炒酸枣仁差异研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ASTREE 型电子舌（法国Alpha MOS 公司）；SP-7412型电动研磨干磨杯（广州市兆利电器实业有限公司）；AL204 型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；3K15 型台式高速冷冻离心机（Sigma 公司）；MH-500 调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；水系微孔滤膜（规格：25 mm×0.45 μm，美国PALL公司）。

1.2 试剂

0.01 mol·L-1氯化钠、0.01 mol·L-1谷氨酸钠、0.01 mol·L-1盐酸（法国Alpha MOS 公司）；屈臣氏蒸馏水。

本实验样品采集于河北、山西、陕西、辽宁等地，样品详细信息见表1。样品经北京中医药大学刘勇教授鉴定为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子。将样品置烘箱内于40 ℃烘干8 h 取出，放凉，置塑封袋中密封备用。炒酸枣仁药材参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（四部）炮制通则项下的单炒法炮制而成。通过查阅文献定炒制具体参数为125～135 ℃炒制7 min[4，20]。生、炒酸枣仁样品均符合《中国药典》2020 年版标准，留样于北京中医药大学中药学院C103实验室。

表1 生、炒酸枣仁样品信息

2 方法

2.1 ASTREE型电子舌介绍

ASTREE 型电子舌，配有特定传感器阵列#6，包括AHS（酸）、CTS（咸）、NMS（鲜）、ANS（甜）、SCS（苦）、PKS（通用）、CPS（通用）7 根交叉敏感电位液体传感器阵列，Ag/AgCl 参比电极，48 位自动进样器及Alpha Soft 数据采集软件。ASTREE 传感器是离子敏感场效应晶体管（ISFET）传感器，包括2 个关键部分：传感器和化学敏感层。传感器的滋味感知直接取决于一个定义的特定传感器，依据调查滋味灵敏度的方法标准ISO3972定义了滋味溶液，建立这些滋味与一个传感器之间的联系。其检测结果只涉及滋味，不能提供不同滋味之间的联系，各滋味响应值范围也是一个相对范围，仅适用于对不同样品内的特定滋味进行比较。电子舌适用于测量的中药样品溶液一般为澄清水提溶液或低浓度有机溶液。为了确保鉴定率和重现性良好（通常标准偏差＜30），通常为每个样品进行5次重复测定。

2.2 电子舌检测过程

ASTREE 型电子舌在检测样品前要使用蒸馏水和0.01 mol·L-1盐酸水溶液进行预平衡和校准，若仪器长时间不使用，首先需要使用0.01 mol·L-1氯化钠、0.01 mol·L-1谷氨酸钠进行诊断。为确保采集数据时稳定、可靠，始终保持在20 ℃条件下进行。处理好的样品盛放于电子舌专用烧杯，样品体积为25 mL，电子舌对每一个样品进行9 次重复测定，每次进行采集的时间通常为传感器引入装有样品的烧杯后120 s，搅拌速度为1 r·s-1（默认）。为确保重现性良好，也确保下一个样品分析时没有样品残留，接下来是清洗循环，清洗溶液为蒸馏水，清洗重复4次，每次清洗时间为30 s。电子舌每秒采集1份数据，为得到重现性良好的数据，取后3次重复测定的100～120 s 内数据的平均值作为各滋味响应值，为后期处理分析用数据。

2.3 供试品溶液制备

将酸枣仁药材粉碎（过四号筛），精密称取粉末0.050 0 g，加入屈臣氏蒸馏水50 mL，称质量，浸泡30 min，加热煎煮30 min，放冷至室温，用适量蒸馏水补足减失质量，转移至50 mL 离心管中，8000 r·min-1离心（离心半径为3 cm）10 min，取上清液经0.45 μm 水系微孔滤膜滤过，得澄清溶液，置于电子舌专用烧杯中待测。每个样品平行操作3次，共计78份样品。

2.4 方法学考察

2.4.1样品生药量质量浓度考察 电子舌适用于检测浓度较稀的澄清水提液，分别对0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg·mL-1的生药量质量浓度进行考察，实时观测在线谱图，在质量浓度为1 mg·mL-1时，各滋味响应值范围无异常，因此，选取1 mg·mL-1作为本实验供试品生药量质量浓度。

2.4.2稳定性试验 取编号为S1的样品，按2.3项下方法制备供品试液，分别于0、1、2、3、4、5 h对样品进行检测。各味道RSD 均小于5%，表明供试液在5 h内稳定性良好。

2.4.3重复性试验 取编号为S1 的样品5 份，按2.3 项下方法制备供试液，各味道中除CTS 的RSD为1.27%，其余RSD均小于1%，说明重复性良好。

2.4.4精密度试验 取2.4.3项下5 份S1 样品中的第五份供试品，连续进样6 次，各味道RSD 均小于1%，说明仪器精密度良好。

3 结果

3.1 配对t检验

生、炒酸枣仁经电子舌检测，各味道响应值结果见表2。利用SPSS 26软件，对共计39对生品和相应制品各味道响应值数据一一配对，进行配对样本t检验，检验结果见表3，其中AHS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS 的双侧P值均小于0.05，可以认为酸枣仁炒制前后以上6 种味道响应值两组数据的差异有统计学意义，说明酸枣仁炒制对以上6 种味道影响较大，且炒制对酸枣仁各味道的影响程度不同，对SCS 影响最大，炒制后苦味增加。而PKS 的P＞0.05，可以认为炒制对该味道无影响或影响极小。

表2 生、炒酸枣仁各味道响应值（， n=2）

表2 生、炒酸枣仁各味道响应值（， n=2）

表3 生、炒酸枣仁各味道响应值配对t检验结果

3.2 生、炒酸枣仁鉴别

3.2.1生、炒酸枣仁特征滋味指纹图谱 根据生、炒酸枣仁各味道响应值原始数据做雷达图，固定代表各味道的7条坐标轴初始值均为0，根据各味道响应值自动变化结束值，得生、炒酸枣仁特征滋味指纹图谱，见图1。从图1中可以直观看出，酸枣仁炒制后AHS、NMS、CPS、SCS味值与生品差异明显，且均为上升趋势，而PKS、CTS、ANS 味值变化不明显。

图1 生、炒酸枣仁特征滋味指纹图谱

3.2.2主成分分析（PCA）PCA 广泛应用于数据降维，从多变量中提取几个能较大反映样本信息变量的“变量”。采用SIMCA 14 软件将生、炒酸枣仁两组样品进行PCA，结果见图2。2 组样品位于2 个不同区域，具有明显组间差异，第一主成分和第二主成分累积方差贡献率为71.2%（＞70%），可以认为生、炒酸枣仁能够通过电子舌区分开。

图2 生、炒酸枣仁PCA得分

3.2.3正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）采用SIMCA 14软件将生、炒酸枣仁两组样品各味道响应值进行OPLS-DA 建模，结果见图3。由图3 可以看出，生、炒酸枣仁被判在2 个不同区域，区分效果明显。该模型对X矩阵的解释率（R2X）=0.9，对Y矩阵的解释率（R2Y）=0.967，该模型的预测能力（Q2）=0.965，说明该模型拟合度、预测性良好。在生、炒酸枣仁OPLS-DA 模型中，以变量投影重要度（VIP）＞1 为筛选标准，结合配对t检验筛选差异标志物，共筛选出3 个差异标记滋味，分别为SCS、CPS、NMS。表明在本实验当前条件下，电子舌检测和OPLS-DA 技术能够对酸枣仁生品及其制品进行判别区分。

图3 生、炒酸枣仁正OPLS-DA得分

4 结论与讨论

本研究旨在从滋味角度探讨生、炒酸枣仁差异，采用电子舌技术对生、炒酸枣仁样品本身滋味进行定量表征，配对t检验结果显示，酸枣仁炒制前后均有酸、咸、鲜、甜、苦味，炒后苦、鲜、酸、甜味值上升，咸味值下降。其中，炒制对苦味影响最大，分析苦味上升的原因，可能与加热炒制后酸枣仁表面略带的焦斑有关。而酸、甜、鲜味值上升及咸味值下降的原因可能与各味道相关的内在成分因炒制发生变化有关，酸枣仁各味道与内在化学成分的相关性有待进一步研究。通过PCA、OPLS-DA 可以实现生、炒酸枣仁的快速识别，而且2 种识别模型起到了相互验证的作用。配对t检验结合OPLS-DA 筛选出生、炒酸枣仁差异标记滋味为SCS、CPS、NMS。综上所述，电子舌技术可以从数值上客观化体现炒制对酸枣仁各味道的影响，可以对生、炒酸枣仁进行鉴别，从滋味角度尝试解释“逢子必炒”及“生熟异治”的原因，为生、炒酸枣仁差异研究提供数据参考，为今后电子舌在中药炮制前后评价研究应用方面提供参考。

在中药研究中，药材味道是中药性状鉴别、品质评价的重要依据。例如，以味酸为佳的山楂、乌梅，以味甜为佳的甘草，以味苦为佳的黄连等。基于“味”的性状鉴别、评价是我国经过数千年传统经验总结形成的具有特色的“辨状论质”理论，凝聚着中药品质评定的精华，是不可或缺的中药鉴别方法，但其是一种感官评价，存在个体差异大、客观性差、无法量化的问题。采用电子舌技术建立基于味道的指纹图谱，可为中药“味”的鉴别提供客观、准确的量化数据，有助于提高中药性状鉴别的标准。

查阅文献发现，电子舌技术在中药研究中应用广泛，已有文献报道，电子舌技术在反映中药材总体特征上具有优势，可基于味觉信息进一步推测中药材中特征性成分含量[21]，其既可以判断药材的基原、产地、炮制程度、储藏时间，也可以用于评价中药的滋味及掩味效果，还可以鉴别中药粉末[22]。在进行中药材滋味评价的同时可结合“气”进行气味融合评价，使鉴别、评价效果更佳。同时，中药的“气”“味”也是中药材内在化学成分的外在表现，而化学成分的类别、含量又与药效相关，药效又决定着药材质量。因此，采用电子舌、电子鼻等智能感官技术结合光谱、色谱技术综合评价生、炒酸枣仁，阐明生、炒酸枣仁中气味与化学成分的相关性，明确气味-药效相关成分是需要继续探究的内容。同时，也需要不断完善方法学，在完善的方法学基础上，可以将该综合评价方法应用到中药质量评价中，即基于智能感官评价-色谱/光谱联用技术或可成为一种科学、客观、合理的中药质量评价新模式。