葡萄VvWDR1 生物信息学分析及其互作蛋白分析

郭建勇，杨波，梁长梅，张鹏飞，温鹏飞*

（1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 信息科学与工程学院，山西 太谷 030801）

WD40 重复蛋白（WD-repeat），又称WD40 结构域蛋白，核心区域由一个简短的、约40 个氨基酸所构成，N 端从甘氨酸和组氨酸的二肽开始，C 端由色氨酸和天冬氨酸终止［1］，作为真核生物中一个重 要 基 因 家 族［2］，参 与 细 胞 信 号 转 导［3］、RNA 修饰［4］、细胞凋亡［5］、免疫反应［6］、基因转录［7］和花青苷合成［8］等代谢，具有重要作用。

目前，拟南芥中已经鉴定出230 个WD40 蛋白成员［9］，也在其它植物中鉴定出不同类型的WD40蛋白，例如谷子［10］、棉花（陆地棉）［11］、水稻［12］，小麦［13］等。前人研究发现，拟南芥中AtTTG1参与调控拟南芥种皮中原花青素、根毛和表皮毛形成以及种子粘液和花青素生物合成［14］，且过表达MdTTG1［15］、VcTTG1［16］、VvWDR1［17］的拟南芥植株AtDFR等基因表达上调并促进花青苷积累，过表达MiTTG1促进拟南芥的根生长及非生物胁迫［18］。InWDR1过表达可增强日本牵牛花蓝色花朵、红色茎中的花青素及深棕色种子色素沉积［19］。柿子中DkWD40 蛋白被证实参与柿果实单宁积累和可溶性单宁向不溶性单宁的转化［20］。

原花青素和花青苷是葡萄中含量最丰富的2种类黄酮类化合物［21］，其代谢调控受到诸如遗传（如结构基因、调节基因等）和环境（如光照、温度等）的调控。前人证实，WD40 蛋白参与形成MBW（MYB-bHLH-WD40）蛋 白 复 合 体，与DFR、UFGT等花青苷合成关键酶基因的启动子相结合，进而调控花青苷的合成［22-23］。在拟南芥中，TT2-TT8-TTG1 复合体通过调节关键酶基因DFR、LDOX、BAN的表达来调节其原花青素的 合 成［24］；在 草 莓 中，FaTTG1 可 与FaMYB9/FaMYB11、FabHLH3 形成一种复合物，该复合物可通过上调ANS和LAR表达从而增加原花色素物 质 积 累［25］；Zhao 等［26］发 现VcWDL2 与VcMY⁃BL1 和VcbHLHL1 相互作用进而参与蓝莓果实花青苷积累和颜色发育；Liu 等［27］发现MrWD40-1 与MrMYB1 和MrbHLH1 互作促进杨梅花青苷积累；An 等［28］发现MdTTG1基因与bHLH 转录因子可形成复合物，进而启动下游花青苷合成基因MdDFR和MdUFGT转 录；葡 萄 中［29］WDR1 通 过与MYBA1 的蛋白相互作用，激活VvCHI3、VvOMT和VvGST4的启动子进而正向调节葡萄浆果的颜色。

前人研究表明，VvMYBPA2参与调控葡萄原花色素的积累［30］，且VvMYC2参与调控葡萄花青苷的积累和茉莉酸合成［31］，VvWDR1异源表达诱导花青苷积累。但葡萄WDR1 蛋白与VvMYB⁃PA2和VvMYC2编码的蛋白是否存在互作，抑或其互作机理尚未见报道。因此，本试验在获得VvWDR1基因CDS 区基础上，首先通过生物信息学分析其特征和预测其功能，进而通过酵母双杂交技术揭示WDR1 与MYBPA2 或MYC2 蛋白的体外相互作用，对于阐明葡萄原花青素与花色苷代谢调控机理具有重要理论意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生长健壮且无病虫害的7 年生‘早黑宝’葡萄（Vitis viniferaL.cv.Zaoheibao），篱架栽培，株行距1.5 m×2.5 m，常规管理。大肠杆菌（E.coli Trans5α）化学感受态购于北京全式金生物技术有限公司，酵母菌株AH109、载体pGBKT7、pGADT7 保存自本 实验室，SD/-Trp、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade 培养基、X-α-Gal、限制性内切酶、T4DNA 连接酶、pMD-19T 购于北京TaKaRa 公司，DNA marker 购于中科瑞泰（北京）生物科技有限公司，质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购于天根生化科技（北京）公司，所需引物合成和测序均由华大科技有限公司（北京）完成。MYBPA2相关载体由实验室前期构建。

1.2 VvWDR1 生物信息学分析

利用ExPASy 网站在线工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）进 行 蛋 白基本理化特性分析，使用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列亲疏水性，利用在线软件SignalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行信号肽和跨膜结构域预测，利用在线软件SPOMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）对其编码氨基酸序列进行二级结构预测，通过SWISS MODEL（https：//swiss⁃model.expasy.org/interactive）网站对其三级结构进行预测，利用CDD 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进 行 蛋 白质保守结构域分析，通过NCBI 官网进行blastp 比对，下载高相似度的序列并结合MEGA 7.0 软件构建系统进化树。

1.3 引物设计及PCR 扩增

根据葡萄已知的WDR1、MYC2核苷酸序列及pGADT7、pGBKT7 多克隆位点，利用Premier 5.0 软件设计合成外挂酶切位点的扩增引物见表1（下划线部分为酶切位点）。

表1 引物序列Table1 Primers Sequence

以‘早黑宝’葡萄叶片cDNA 为模板，加入上、下游引物、2×Taq PCR MasterMix、DEPC-H2O后PCR 扩增目的片段，经1%琼脂糖凝胶电泳分析后送至华大测序。

1.4 酵母载体构建及鉴定

将测序正确的克隆载体与酵母双杂交载体同时双酶切，切胶回收目的片段和载体片段，用T4连接酶进行连接转化至Trans 5α感受态细胞，抗生素筛选培养，从平板中挑取数个菌落在30 ℃、200 r·min-1培养条件下，振荡过夜培养，然后提取质粒进行酶切验证。

1.5 酵母重组质粒的转化

采用PEG/LiAc 法将诱饵载体pGBKT7-WDR1转化酵母感受态细胞中，参照董燕梅［32］的方法，略有修改。

1.6 重组质粒毒性及自激活检测

随机各挑取5 个单克隆于5 mLSD/-Trp 液体培养基30 ℃震荡培养，24 h 后测OD600，选取转化成功的酵母菌阳性单克隆，接种于SD/-Trp/Xα-Gal平板上，倒置培养并观察颜色变化。

1.7 共转化酵母感受态细胞

采用PEG/LiAc法将pGBKT7-53/pGADT7-T（阳性对照）、pGBKT7-Lam/pGADT7-T（阴性对照）、pGBKT7-WDR1/pGBKT7-MYBPA2、pGB⁃KT7-WDR1/pGADT7-MYC2质粒分别共转化酵母感受态细胞中，吸取100 μL 涂布于SD/-Trp-Leu 营养选择性培养基平板上，30 ℃倒置2~4 d，观察菌落生长情况，待菌落长出后接种到SD/-Trp-Leu-His-Ade 选择性培养基上，30 ℃倒置2~4 d，待菌落长出后接种到SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板上，30 ℃倒置并观察颜色变化。

1.8 数据处理

运用MEGA 7.0 软件进行系统发育树分析，利用DNAMAN 6.0 进行序列比对，Photoshop CS6 进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 VvWDR1、VvMYC2 扩增

以‘早黑宝’葡萄cDNA 为模板，经PCR 扩增后，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示分别扩增出分子大小为1 011 bp，1 827 bp 的条带，与NC⁃BI 公布的序列大小相符（图1）。

图1 WDR1、MYC2 基因扩增结果Fig.1 Amplification results of WDR1 and MYC2

2.2 VvWDR1 序列分析

在NCBI 官网查找VvWDR1基因（GenBank登录号：ABF66625），全长cDNA 序列1011 bp，编码336 个氨基酸。利用ExPASy 网站在线工具ProtParam 对VvWDR1编码蛋白的基本理化特性分析，结果得出该蛋白分子量约为37.8 kD，等电点为5.07，分子式为C1671H2588N458O518S11，不稳定系数为54.60，推测其为不稳定蛋白。该蛋白中丝氨酸最多12.8%，其次亮氨酸8.3%、异亮氨酸7.7%，最少是半胱氨酸1.2%。使用Protscale 分析氨基酸序列亲疏水性，推测该蛋白为疏水性蛋白。利用在线软件SignalP-5.0 和TMHMM 进行信号肽和跨膜结构域预测，显示该蛋白无信号肽且不具有跨膜结构域。通过SPOMA 网站对VvWDR1编码氨基酸序列进行二级结构预测，结果显示该蛋白结构原件比例是无规则卷曲39.29%，β-折叠26.79%，α-螺旋22.02%，β-转角11.90%。SWISS MODEL 对三级结构进行预测（图2）。

图2 VvWDR1 蛋白三级结构图Fig.2 Tertiary structure of VvWDR1 protein

利用NCBI-CDD 数据库对蛋白质保守结构域分 析 发 现，VvWDR1编 码 的 蛋 白 有5 个WD40 蛋白基序，具有WD40 典型的保守结构域（图3）。

图3 WDR1 蛋白保守结构域分析Fig.3 Conserved domain analysis of WDR1 protein

2.3 VvWDR1 蛋白的系统发育树构建及同源序列比对

对牵牛花、草莓等11 种植物与VvWDR1同源的蛋白序列构建系统发育树（图4），发现：VvW⁃DR1编码的的氨基酸与牵牛花（Pharbitis nil）In⁃WDR1：AB232779、草 莓（Fragaria ananassa）FaTTG1：JQ989287、玉 米（Zea mays）ZmPAC1：AAM76724、陆 地 棉（Gossypium hirsutum）GhTTG1：AAM95641/GhTTG2：AAM95643、越橘（Vaccinium corymbosum）VcTTG1：MH717246、苹果（Malus domestica）MdTTG1：AAF27919、茶树（Camellia sinensis）CsWD40：QLI42590、葡 萄（Vitis vinifera）VvWDR1：ABF66625/VvWDR2：ABF66626、紫 苏（Perilla frutescens）PfWD40：AB059642、拟 南 芥（Arabidopsis thaliana）AtTTG1：NM122360、矮 牵 牛（Petunia hybrida）PhAN11：AAC18941 等相似度较高（图4），其中与PhAN11、AtTTG1的相似度分别高达81.95%、75.95%。

图4 VvWDR1 编码蛋白与其它物种WD40 蛋白系统发育树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis between VvWDR1 encoded pro⁃tein and WD40 protein from other species

2.4 克隆载体构建与鉴定

选取测序成功的pMD-WDR1、pMD-MYC2和空载体pGADT7、pGBKT7 同时用相对应的内切酶进行双酶切。经双酶切验证分别出现1011 bp的WDR1（图5A）、1827 bp 的MYC2（图5B）以及空载体pGBKT7（图5C）、pGADT7（图5D）目的条带，测 序 结 果 显 示WDR1（99.51%）、MYC2（99.34%）均在99%以上，且没有出现移码，编码的蛋白没有改变，可以进行后续实验。

图5 克隆载体及表达空载体双酶切Fig.5 Double digestion of cloning vector and empty expression vector

2.5 酵母重组载体的构建及鉴定

双酶切验证后，分别出现1011 bp 的pGB⁃KT7-WDR1（图6A）、1827 bp 的pGBKT7-MYC2（图6B）和pGADT7-MYC2（图6C）的基因目的条带，且测序结果同源性均在99%以上，表明，酵母重组载体构建成功。

图6 酵母重组载体双酶切验证Fig.6 Double digestion verification of yeast recombinant vector

2.6 诱饵蛋白毒性和自激活检测

将转化的酵母单菌落及pGBKT7 空载体接种到5 mLSD/-Trp 营养选择性培养基后培养24 h 的OD600值均大于0.8（表2），证实：重组质粒均成功转化至酵母AH109 细胞中且对酵母均无毒害作用。

表2 诱饵载体OD600 平均值Table2 The average OD600 of bait plasmid

将上述转化的酵母菌落接种到SD/-Trp/Xα-Gal平板上（图7）。阳性对照及pGBKT7-MYBPA2的转化酵母菌均出现蓝色菌落。而pG⁃BKT7-WDR1、pGBKT7-MYC2的 转 化 子 未 变蓝，表明WDR1、MYC2编码的蛋白不具有酵母自激活功能。

图7 转录自激活活性分析Fig.7 Transcriptional activation activity analysis

2.7 酵母双杂交互作分析

将pGBKT7-WDR1分别与pGADT7-MYB⁃PA2、pGADT7-MYC2共转化酵母细胞作为试验组，将pGBKT7-53 与pGADT7-T 作为阳性对照，pGBKT7-Lam 与pGADT7-T 作为阴性对照，转化酵母细胞后均涂于SD/-Trp-Leu 营养选择性培养基平板上，倒置3 d 观察菌落生长情况。将SD/-Trp-Leu 平板上生长良好的菌落接种于SD/-Trp-Leu-His-Ade 和 SD/-Trp-Leu-His-Ade/X⁃α⁃Gal平板上，二缺平板上菌落均有生长（图8），表明载体已成功转入酵母细胞；阳性对照和试验组均可以在四缺平板上生长，表明在酵母水平WDR1蛋白可以和MYBPA2、MYC2蛋白互作。在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板上，阳性对照和pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYC2共转化酵母变蓝，表明，WDR1蛋白可以和MYB⁃PA2、MYC2蛋白互作，且WDR1 和MYC2 蛋白在酵母中可以结合成稳定的络合物。

图8 酵母双杂交结果Fig.8 Result of yeast two-hybrid

3 讨论

WD40 蛋白序列以N 端11-24 个残基处GH（Gly-His）二肽开始，C 末端以WD（Trp-Asp）氨基酸结尾，因此称为WD40 蛋白。这一类古老的蛋白家族结构高度保守，一般含有4~16 个WD40 重复基序，序列在不同植物中也十分保守。本试验中从‘早黑宝’葡萄中分离的VvWDR1基因所编码的蛋白具有5 个WD40 重复基序，与严莉等［33］的结 果 一 致。Matus［17］于2010 年 首 次 从 葡 萄 中 分 离出WDR1基因，并通过亚细胞定位确定其位于细胞核，异源表达WDR1基因可以促进拟南芥花青素的积累。AtTTG1、PhAN11已被证实可参与植物花青素和原花青素等的生物合成［24］，本试验的系统进化树分析表明，葡萄WDR1 与AtTTG1，PhAN11 等聚为一类，这与Matus［17］的结果一致。

本试验中通过构建酵母双杂交诱饵载体pGB⁃KT7-WDR1，且通过试验证明其对酵母AH109 无细胞毒性。通过检测AH109 报告基因MEL1的活性，证明诱饵载体pGBKT7-WDR1在酵母AH109中无自激活作用，该诱饵载体可用于筛选酵母双杂交系统中与WDR1 互作的蛋白，这与王怀琴等［34］的结果相似。

WD40 为MYB-bHLH 相互作用提供了一个对接平台，使MYB-WD40-bHLH 可以形成三元复合物从而调节花青苷等的生物合成［22］。前人研究证实拟南芥中的WD40 蛋白AtTTG1 可与TT2（MYB）、TT8（bHLH）相互作用从而调控其原花色素积累［28］。而对于葡萄中的WDR1 蛋白，在拟南芥中的异源表达研究证实了其可以调控拟南芥花青素的合成［23］，并通过互作研究证明了WDR1可与一些MYB 和bHLH 蛋白互作从而调控花青素的合成，例如Xie 等［29］研究发现WDR1 蛋白可与MYBA1 蛋白互作正向调控葡萄浆果的颜色。酵母双杂交结果表明，阳性对照pGBKT7-53与pGADT7-T和试验组pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYC2、pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYBPA2共转化酵母在SD/-Trp-Leu-His-Ade 四缺平板上均正常生长，证实了葡萄WDR1 蛋白与MYB⁃PA2、MYC2 蛋白之间存在互作。这与前人在拟南芥［24］、草莓［25］、苹果［28］中研究结果相似。此外，研究 表 明 ：DkMYB2-DkMYC1-DkWDR1［20］、AtTT2-AtTT8-AtTTG1［24］复 合 体 调 控 下 游 类 黄酮生物合成关键基因ANR、DFR等表达，进而调控原花色素合成；VcWDL2-VcMYBC1-Vcb⁃HLH［26］、MrWD40-1-MrMYB1-MrbHLH1［27］复 合体正向调控花青苷合成。因而，WD40 蛋白参与形成MBW 复合体，进而调控类黄酮代谢。本试验中发现葡萄WDR1 与MYBPA2、MYC2 蛋白存在互作，推测葡萄WDR1 蛋白可能与MYBPA2、MYC2蛋白互作进而调控原花色素和花青苷的积累。

4 结论

本试验克隆得到葡萄WDR1基因，对其序列进行了生物信息学分析；并在构建酵母双杂交表达载体pGBKT7-WDR1、pGADT7-MYC2、pGB⁃KT7-MYC2的基础上，证实了VvWDR1在酵母体系中不具有转录自激活功能，且葡萄WDR1 与VvMYBPA2、VvMYC2编码的蛋白存在互作。