大豆孢囊线虫侵染绿豆的国内首次报道

耿晶晶，杨艺萌，尹添，赵增旗，2，徐玉梅*

（1.山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801；2.新西兰皇家研究院 土地环境研究所，新西兰 奥克兰 1142）

绿豆（Vigna radiata）隶属于豆科，是我国重要的杂粮作物。中国是绿豆的原产国，主要种植区在黄淮河流域和东北，包括内蒙古、吉林、山西、河南和安徽等地［1］。2019 年我国绿豆产量为57.30 万t，占全球总产量的2.1%，居世界前列［2］。

孢囊线虫（Cyst nematodes）指在根际部形成的孢囊状线虫，主要包括孢囊属（Heterodera）、球形孢囊属（Globodera）和仙人掌孢囊属（Cactodera），其中具有重要经济价值的种类有大豆孢囊线虫（H.glycines）、小麦孢囊线虫（H.avenae和H.filipjevi）、甜菜孢囊线虫（H.schachtii）以及马铃薯孢囊线虫（G.rostochiensis和G.pallida）等，孢囊线虫可引起植物病害，带来严重的经济损失［3-6］。Epps 等［7］首次在室内接种证明绿豆是大豆孢囊线虫的新寄主，后相继在绿豆上报道的孢囊线虫有木豆孢囊线虫（H.cajani）［8-9］和野生豆孢囊线虫（H.sojae）［10］。

本研究为明确山西省晋中东阳县绿豆上孢囊线虫的病原种类，采用传统形态学和分子生物学结合的方法，对其进行种类鉴定和致病性测定，为进一步制定相应防控对策提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 线虫的采集、分离和标本制作

1.1.1 采集

2020 年6 月在山西省晋中市东阳县（37°32′15′′N，112°40′02′′E，802 m）绿豆育种田中采集发病植株及其根际土壤样本，记录采集相关信息，带回实验室冷藏保存备用。

1.1.2 分离

根际孢囊采用直接挑取法分离，土壤中孢囊采用漂浮法分离［11］。分离的孢囊一部分用于孵化二龄幼虫，另一部分用于致病性测定。

1.1.3 标本制作

将二龄幼虫用4%福尔马林热杀死固定［12］，然后用Seinhorst 法进行脱水［13］，蜡圈法制成永久玻片以备形态测量。参照段玉玺［11］的方法制作阴门锥并观察测量。

1.2 孢囊线虫的形态学观察

1.2.1 光学显微镜的形态观察和测量

将上述制作好的永久玻片置于尼康显微镜下进行观察，用软件NIS Elements version 4.10 进行测量和拍照，记录相关测量数据，并计算a、b、c 和c′等de Man 数值。

1.2.2 扫描电镜样品的制备及观察

挑取完整孢囊和二龄幼虫放入2.5%戊二醛溶液中固定14 d，用灭菌dd H2O 清洗3 次，依次用30%、70%、80%、90%、95% 乙 醇 洗 脱10 min，100%乙醇处理2 次，每次15~20 min，用叔丁醇置换无水乙醇2 次，每次10 min，将干燥后的线虫样本置于冷冻干燥机（JEOL JFD-320）中过夜，随后进行粘样，喷金镀膜。将制作好的样品置于扫描电镜（JEOL JSM-6490LV）下观察并拍照。

1.3 分子序列分析

1.3.1 DNA 的提取

采用蛋白酶K 法进行DNA 提取［14-15］。

1.3.2 PCR 的扩增

采用通用引物对孢囊线虫的28S、ITS 和COI基 因 进 行PCR 扩 增。28S 引 物：D2A（5’-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG-3’）和D3B（5’-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3’）［16］。ITS 引物：TW81（5’-GTT TCC GTA GGT GAA CCT GC-3’）和AB28（5’-ATA TGC TTA AGT TCA GCG GGT-3’）［17］。COI 引物：JB3（5’-TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT TAT-3’）和JB4.5（5’-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA ATG-3’）［18］。扩增程序为：95 ℃2 min，95 ℃10 s，53 ℃30 s，72 ℃60 s，40 次循环，72 ℃7 min，用1%的核酸凝胶电泳检测。将PCR 扩增产物直接送至生工生物公司（上海）股份有限公司进行测序。

1.3.3 系统发育树的构建

将测序结果用Sequencher 5.2.2 整理编辑，从NCBI 下载孢囊属Heterodera类群，用Cryphodera brinkmani做外群，用Geneious Prime 2019［19］分别构建ITS+28S 联合基因系统发育树和COI 基因系统发育树，用FigTreeV 1.4.3 查看系统发育树。

1.4 致病性测定

1.4.1 绿豆植株准备

绿豆品种“并绿9 号”由山西农业大学农学院小杂粮研究中心提供。将绿豆种子用次氯酸钠溶液消毒后，播种在装有经高压灭菌（150 ℃，烘干1.5 h）的肥沃土壤与育苗基质1∶1 混合的花盆中，每盆播种3 株，共播种20 盆。

1.4.2 致病性的测定

待绿豆出苗后至两叶一心期进行间苗，每盆留有1 株。接种1.1.2 分离得到的孢囊，每盆接种12个孢囊，共接种10 盆，其余10 盆作为空白对照。采用常规管理，40 d 和46 d 后拔出绿豆植株观察是否有孢囊形成，并采用次氯酸钠-酸性品红染色观察孢囊线虫在根际部的分布［20］。

2 结果与分析

2.1 症状观察

孢囊线虫侵染绿豆的田间症状表现：植株发育不良，秧苗矮小，子叶和真叶变黄，逐渐干枯（图1A、图1B）。病株根部根系不发达，侧根减少，须根增多，根瘤减少（图1D），且根上有许多淡黄色小颗粒（图1C），即为孢囊线虫的雌虫（图1E）。在发病田绿豆根际土壤中采集的种群密度为每100 g 湿土70个孢囊。

图1 孢囊线虫侵染绿豆的田间症状Fig.1 Symptoms of mung bean infected by cyst nematodes in the field

2.2 形态学鉴定

2.2.1 特征描述

孢囊：柠檬形（图2A），初期白色，后期为褐色或黄褐色，长412~571 μm，宽223~284 μm。阴门锥明显（图2B），阴门膜孔为双半膜孔型（图2C），阴门裂35.9~48.7 μm，膜孔长39.7~42.4 μm，膜孔宽28.0~36.3 μm，下桥长89.2~97.8 μm（图2E），泡状突较多（图2D），排列不规则。

卵：长椭圆形，长97.4~103 μm，宽44.0~46.8 μm，卵壳透明光滑，内有折叠的一龄幼虫（图2F）。

二龄幼虫：虫体呈蠕虫形，体长401~456 μm。唇区缢缩（图2G），口针细长，长21.5~25.0 μm，口针基部球明显。中食道球圆形，长12.3~20.0 μm，宽8.9~11.9 μm。排泄孔明显，位于半月体后端，距离体前端88.4~108 μm。侧线4 条（图2I）。尾圆锥形，透明尾明显，长19.2~31.1 μm（图2H）。

图2 孢囊和二龄幼虫形态特征Fig.2 Micrographs of the cyst and J2 of cyst nematode

雄虫：未发现。

2.2.2 形态测计值

测量结果见表1。

2.3 分子生物学鉴定

测序结果表明，绿豆根际孢囊线虫的28S 的扩增 片 段 长 度 为 710 bp（GenBank 登 录 号OK012079），将其与GenBank 中已知序列进行对比，与大豆孢囊线虫（H.glycines）（KX017535）和苜蓿孢囊线虫（H.medicaginis）（MH793872）的序列相似度均为100%。ITS 区域序列（OK001855）长度 为934 bp，与 大 豆 孢 囊 线 虫（MT254745，MG845112，MG845079 和MG845051）的序列相似度达100%，与苜蓿孢囊线虫（AF274391）的序列相似率达99%。COI 基因扩增片段的长度为395 bp（GenBank 登录号OK001854），与大豆孢囊线虫（MT644158，MK188448 和KC172914）的序列相似度 为 99%，与 苜 蓿 孢 囊 线 虫（MK093162 和MK093166）的序列相似率为96%。

以布林克曼隐皮孢囊线虫（Cryphodera brink⁃mani）为外群，构建ITS+28S 联合系统发育树显示（图3），本试验种群与大豆孢囊线虫和苜蓿孢囊线虫位于同一分支上，置信度达100%；COI 系统发育树显示（图4），本试验种群与大豆孢囊线虫（MK093154，MK093153，KY775596，MN720172）位于同一个分支上，置信度达100%，而苜蓿孢囊线虫则单独位于另一分支上。

图3 基于大豆孢囊线虫ITS+28S 基因联合构建的系统发育树（置信度>50%注在相应的节点处）Fig.3 Phylogenetic tree of Heterodera glycines inferred from ITS and 28S rRNA gene sequences（posterior probability values exceed⁃ing 50% are given on appropriate clade）

图4 基于大豆孢囊线虫COI 基因构建的系统发育树（置信度>50%注在相应的节点处）Fig.4 Phylogenetic tree of Heterodera glycines inferred from COI rRNA gene sequences（posterior probability values exceeding 50% are giv⁃en on appropriate clades）

2.4 致病性测定

在接种40 d 后，在绿豆根部未观察到孢囊，对其根部染色后，观察到线形J2（图5A、图5B）和腊肠状的J3 虫态（图5B），以J2 居多。接种46 d 后，根部观察到少数孢囊（图5D），染色后根部可观察到J2、J3 和J4 虫 态，以J3 居 多，J2 较 少，仅 观 察 到1 个J4（图5C），此结果说明孢囊线虫回接到健康绿豆上可引起植株发病，形成孢囊（表2）。

图5 绿豆致病性测定的根部染色结果图Fig.5 The staining results of the mung bean roots inoculated with cyst nematodes

表2 健康绿豆接种大豆孢囊线虫后不同时期体内虫态及数量统计Table 2 The stage and number of cyst nematodes in the healthy mungbean after inoculation

3 讨论

大豆孢囊线虫是大豆生产上的毁灭性病害之一，在世界大豆产区普遍发生。在中国1899 年首次在东北地区发现，目前在黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古、河北、河南、山东、山西、陕西、安徽、北京、浙江、江苏等22 省大豆产区发生，发生面积200 多万hm2，以东北和黄淮海大豆产区发生最严重，每年造成高达1.2 亿美元的损失［10，21］。主要寄主有大豆、菜豆、红小豆、豌豆和食用豆等豆科植物［10，22］。

本试验种群的阴门锥与Mulvey［23］的报道一致。孢囊及二龄幼虫数据与Ichinohe［24］的原始描述基本吻 合，除 孢 囊 体 较 窄（223~284 μmvs350~670 μm）。此外，在分子序列特征上来看，大豆孢囊线虫和苜蓿孢囊线虫两者的ITS（99%）和28S（100%）序列均相近，用单独序列相似度和系统发育树无法将两者分开，本试验构建的ITS+28S 联合序列发育树也无法将两者区分。但是COI 系统发育树则可以很好地将两个序列相近种区分开来，本试验结果与Powers 等［25］结果一致。

Epps 等［7］首次在室内接种证明大豆孢囊线虫可侵染绿豆；李秀花等［26］采用田间盆栽的试验方法，将大豆孢囊线虫3 号生理小种接种到绿豆上，38 d 后在土壤中可观察到1 个孢囊；本论文首次报道了大豆孢囊线虫在田间侵染绿豆发病，致病性接种后可以侵染绿豆，并能完成其生活史形成孢囊。而甄浩洋等［27］采用人工接种野生豆孢囊线虫可侵染绿豆，但不能完成生活史。

种植抗病品种是孢囊线虫病最经济有效的防治措施，而大豆孢囊线虫生理小种的鉴定是抗性品种培育、鉴定、推广的前提和依据。目前大豆孢囊线虫多数生理小种已在全球报道，美国报道有13 个生理小种［28］。在我国也有生理小种的相关报道［29-30］，现报道的生理小种有11 个，其中1 号、3 号和4 号在全国范围内面积最大、分布最广，3 号小种致病力最弱、4 号最强，3 号是东北地区的优势小种，而1 号和4 号是黄淮海地区的优势小种［31］。已有研究表明中国黄淮海和美国密苏里州大豆产区的优势小种均由1 号小种演变为致病性更强的2 号小种［32-35］。山西省是国内大豆孢囊线虫感染最严重的地区，优势小种是致病力较强的4 号和12 号小种［32，36］。本研究只对绿豆上的孢囊线虫进行了种类鉴定和致病性测定，具体的生理小种类型还有待于进一步鉴定。

4 结论

本试验运用形态学和分子生物学相结合，将绿豆病田中采集到的孢囊线虫种类鉴定为大豆孢囊线虫。将大豆孢囊线虫回接到健康绿豆上，40 d 后根部观察到J2 和J3，46 d 后观察到J4 和孢囊形成。首次在中国发现大豆孢囊线虫在田间侵染绿豆，在绿豆产区要及时监测，并采取轮作措施或杀线虫剂等进行合理防控。