菌藻生物膜反应器处理养殖污水的应用

文│翁波 尹艳飞 冉茂良 何俊 钟元春（湖南农业大学动物科学技术学院）

畜牧业作为我国的重要组成部分，为经济的快速发展提供了重要支撑。近年来，现代畜禽养殖业正朝着规模化、集约化方向发展，在满足人们对畜产品需求的同时，造成了大量畜禽养殖废水的排放。当前，我国每年的畜禽粪污排放量大约为38亿吨，其中猪、牛、家禽每年产生的粪污量分别为18亿吨、14亿吨、6亿吨，分别占总量的47%、37%、16%。畜禽养殖的污水主要由动物排泄物和养殖场地清洁废水组成，具有化学需氧量和重金属含量高、且处理难度大等特点，给环境带来了一系列的污染问题。为实现畜禽养殖业与生态环境可持续性和友好型发展，生物处理广泛应用于畜禽养殖污水中。由于传统的生物技术在处理养殖污水时存在效果不佳、耐受负荷冲击能力差、处理时间长等问题。因此，一种新型的绿色处理技术－藻菌共生系统，因其在提高有机碳、氮和磷的去除效能和减少废水处理过程中能源成本等方面存在较大潜力，受到国内外的广泛关注。相继开展了悬浮菌藻系统、固定化菌藻系统及菌藻生物膜系统等方面的研究，其中菌藻生物膜系统能够保持优势菌种和藻种不易流失，而且占地面积小、成本低、节省能耗，较前两种菌藻共生系统的处理效果更具优势。本文综述了菌藻生物膜反应器处理畜禽养殖污水的研究进展，通过阐述菌藻生物膜附着生长的菌藻种类及载体选择、菌藻生物膜组成和形成、菌藻之间相互作用机理等内容，结合菌藻生物膜反应器处理畜禽养殖污水的应用成果，为菌藻生物膜反应器在畜禽养殖污水中的应用与推广提供参考。

一、菌藻生物膜反应器

1.菌藻生物膜反应器中菌藻种类。首先，生物膜反应器菌类。细菌是菌藻生物膜上的主要微生物，包含硝化细菌，反硝化细菌、光合细菌等。硝化细菌包含氨氧化细菌（NH4+-oxidizing bacteria，AOB）和亚硝酸盐氧化菌（NO2-oxidizing bacteria，NOB）。常见的AOB有亚硝化单胞菌属和亚硝化螺菌属，属于β-变形菌纲，以上菌属能够在短程硝化过程中将NH4+-N基于好氧条件下通过单加氧酶和羟胺氧化还原酶催化作用转换为NO2--N。NOB将NH4+-N氧化为NO3--N终产物，这个过程简称为全硝化过程，主要属于α-变形菌纲、δ-变形菌纲、γ-变形菌纲以及硝化螺菌纲。反硝化细菌大多为革兰氏阴性细菌，如假单胞菌属、产碱杆菌属、副球菌属和硫杆菌属，还有一些革兰氏阳性菌如芽孢杆菌属和嗜盐古细菌如反硝化盐富饶菌。反硝化细菌利用NO2--N作为电子受体和有机物作为碳源将氮氧化物（NO2--N和NO3--N）转化为N2，从而实现污水中氮的去除。光合细菌根据细菌内所含电子和色素的不同分为产氧光合细菌和不产氧光合细菌，如：蓝细菌、原吕菌为产氧光合细菌；紫色细菌和绿色细菌为不产氧光合细菌。

其次，菌藻生物膜反应器中藻类。藻类是一类多为单细胞、群体或多细胞的叶状体且结构简单，含有叶绿体，能够进行光合作用的自养型生物。在自然界中藻类分布广泛，且种类繁多。据报告，目前藻类在地球上大概存有3万余种，其中发现微藻有2万株左右。目前研究表明绿藻门在菌藻生物膜上占据优势，其中以小球藻和栅藻因具有适应能力强、易于培养、对富含氮磷的污水净化效果明显等特点，被国内外学者常用作为生物膜上研究最多的两个绿藻属。彭苑媛等通过在同等的操作条件下，采用小球藻构建的微藻生物膜-膜光生物反应器系统进行长期稳定的培养，结果表明小球藻生长周期是普通膜光生物反应器的3倍，从而缩短了对微藻进行的收获频率，减少了收获成本。Garcia等将绿藻、蓝藻、硅藻和硝化细菌一起培养形成了稳定的菌藻生物膜，对养殖污水中的氨氮和硝氮的去除率高达97%和95%。张文艺和张正红等研究发现小球藻属和栅藻属是菌藻生物膜反应器中附着生长的主要优势藻属，而且藻类数量较多，计数有1.01x104CFU/毫升，同时研究还表明该生物膜反应器能有效地去除沼液中的污染物和维持系统的稳定。

2.菌藻生物膜反应器载体。菌藻生物膜形成及代谢活动离不开载体，目前，已有针对不同载体在菌藻生物膜上进行研究，并将载体材料归纳为两类：天然载体和合成载体。天然载体分为有机天然载体和无机天然载体。有机天然载体包括人工水草、菖蒲、圆币草、聚草等，无机天然载体包括珊瑚石、矿粘土、高岭土、长石粉、珪藻土、海藻酸钙等。合成载体包括聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙等。载体与菌藻生物膜形成息息相关，载体的亲疏水性、粗糙度、孔隙结构、生物相容性等性质是影响菌藻生物膜形成的重要因素。

载体的亲疏水性对菌藻生物膜的形成，是通过微生物的静电力作用黏附在载体界面，缩短与载体界面的距离，然后载体界面上的疏水基团代替界面上附着的水分子吸附微生物，从而促进生物膜的形成。Sekar等对比不同的疏水材料和亲水材料以及有一定生物毒性的材料对微藻吸附培养，结果发现疏水材料表面的吸附效果均优于亲水材料。此外，微生物既可以黏附于疏水性的载体界面，也可黏附于亲水性的载体界面。Huang等证明了聚偏二氟乙烯/聚四氟乙烯复合膜具有高强度，良好的生物相容性和永久亲水性的特点，并能有效的吸附微藻细胞。Ista等研究发现葡萄球菌更易黏附于表面能较高的亲水载体界面上。因此，载体界面的亲疏水性不能用来判断载体界面是否有利于生物膜的形成及结构稳定。载体界面的粗糙度通过增加与菌藻细胞的接触面积，增强了细胞的初始黏附力，而且表面粗糙度的增加可减少液体流动相生物膜中细菌细胞所承受的外部水剪切力，有利于生物膜的稳定。

材料的孔隙结构和大小不仅直接影响生物膜上菌藻营养物质的传送，还为菌藻细胞附着和生长提供了安全生存环境，同时，多孔结构还可以缩短紧密堆积的细胞之间的扩散距离。段丹如等将高孔隙低密度的多孔金属泡沫镍为吸附载体，利用SiO2颗粒改变载体表面，使其表面形成许多均匀的微孔，并增加泡沫镍表面的生物相容性和粗糙度，以提供相对静态的流体动力学环境，结果证明了在泡沫镍改性表面上微藻生物膜附着的可行性和有效性。

3.菌藻生物膜组成与形成。菌藻生物膜是由细菌、藻类、原生动物等微生物及其分泌的胞外高分子聚合物组成，胞外高分子聚合物也称为胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）。EPS具有复杂的化学组成，含有多聚糖、蛋白质、磷脂和核酸等化学物质，其中多聚糖在EPS中占40%～95%，是最主要的成分。EPS表面含有的多个亲/疏水性官能团以及正电/负电结合位点在菌藻生物膜形成中发挥着重要的作用。

微生物附着在载体上形成菌藻生物膜的过程可分为迁移、黏附、生长成熟和老化等四个阶段。第一，迁移阶段，水体中游离的微生物在受到扩散作用和水力动力等定向力为主导力量下逐渐地向载体表面趋近，然后再在布朗运动、重力、静电力、黏附力及沉降作用等非定向力的主要作用力下，微生物不断地接近载体表面。第二，黏附阶段，微生物在初步接触到载体表面后，处于可逆的附着状态，由于水体中存在各种外力、载体表面的粗糙度在初始附着的微生物与载体表面之间起着重要的主导力量，由于微生物自身的作用力不强，使其再次脱落到水体环境中，因此，不断地处于附着和脱离的状态。随着微生物与载体表面充分接触的时间不断延长，当微生物确定附着位点后通过自身会分泌出黏性的胞外物质，如：分泌蛋白、多糖等物质稳固地附着在载体表面，此时的微生物化学作用力增强，远大于水力剪切力，使其不易被冲刷掉，进而形成不可逆的状态。因此，可逆附着为不可逆附着奠定基础，而不可逆附着的过程是微生物附着和生长的关键。第三，生长成熟阶段，载体表面的微生物在深度附着后，可获得长期稳定的生存环境，形成微生物群落，微生物群落中藻类的生长速度慢于细菌，细菌通过群体感应的分子通信系统调节胞外聚合物分泌并黏附在载体表面形成聚集体。然后藻类中的优势藻群黏附在胞外聚合物上，获取其中的碳源和氮磷无机盐代谢增殖并促使更多微藻附着在载体上，当细菌和藻类的比例达到生长稳定状态后，并发展为成熟的菌藻生物膜。第四，老化阶段，随着水体中的底物和O2不断消耗，以及环境中机械力的作用下，导致微生物附着力降低，最后脱落，菌藻生物膜由稳定状态逐步走向衰老阶段。

4.菌藻生物膜的影响因素。对于菌藻生物膜的影响因素研究，大多数集中在影响藻类生长活性、细菌群落数量和结构、EPS的形成及沉降等方面单一因素的研究。有研究报道，菌藻生物膜中的细菌群落总体数量随着光照强度不断增加而增加，细菌群落结构优势菌群中的硝化螺菌属和假单胞菌属的相对丰度平均值在光照强度4750勒克斯下显著高于7580勒克斯组，红杆菌属相对丰度随着光照强度的增大而逐渐升高。张晗等通过比较曝气头曝气和膜曝气两种曝气方式对菌藻生物膜反应器的影响，结果发现以膜曝气为基础的生物膜反应器相对于以曝气头曝气为基础的生物膜反应器，无需吹脱以及其强大的有机碳碳化能力为藻类的生长提供了更多的无机碳，也为细菌提供了生存环境，同时膜曝气光生物膜反应器能更好地适应外来冲击，从而表明，膜曝气提高了菌藻的生存环境促使藻类的积累而加速生物膜的形成，并提高污染物的去除效率。目前，其影响因素主要分为物理因素、化学因素、生物因素及工艺运行条件等四类，分别包括光照和温度、营养物可利用性、CO2、pH、物种间的竞争、藻类捕食者、载体性质及反应器参数设计等。实际上养殖污水环境复杂多变，菌藻生物膜反应器是由各种因素综合影响，而不是受某一种因素单独地作用，从整体上来研究菌藻生物膜的影响因素还未有报道。

二、菌藻生物膜反应器中菌藻相互作用

1.营养交换。营养交换是影响菌藻之间相互作用的一种方式，在物质传递当中，既存在着对彼此的代谢物的相互利用，在营养物质方面菌藻之间又存在相互竞争抑制。菌藻的物质循环利用主要表现在两个方面：一是微藻以光作为能源，通过光合作用利用污水中的CO2释放供好氧菌吸收的O2，为细菌呼吸中提供电子受体，产生CO2可供微藻的生命活动；二是微藻利用光合作用将污水中含有的CO2、HPO42--P、NH4+-N等无机物，合成自身物质并产生溶解性的有机物，这些有机物被细菌吸收、转化，然后分解为可被微藻继续利用的无机物原料。此外，细菌和微藻共同生长过程中，产生的碳水化合物、蛋白、腐植酸及多种生长因子等活性物质可作为彼此的营养，有研究发现，藻类生长所必需的微量元素中的维生素B12由共生菌提供。菌藻之间的竞争机制主要体现在同种藻类和细菌、菌藻之间对污水中营养物质争夺以及菌藻之间分泌具有拮抗作用的活性物质。Jansson研究发现污水环境中的磷酸盐更优先于被细菌吸收，然后才是微藻。当环境黑暗条件时，微藻进行呼吸作用，与细菌竞争O2。细菌分泌溶藻性活性物质抑制小球藻的生长，而且有些藻类产生的活性物质抑制细菌的生长繁殖，还有研究发现小球藻对革兰氏阳性菌和革兰阴性菌有良好的抗菌作用。总之，营养交换有利于菌藻生物膜对畜禽养殖污水环境作出相应的调整，并能有效去除养殖污水中的污染物。

2.信号调控。微生物膜上的细菌和微藻之前存在复杂而精密的“交流”，主要表现在通过分泌信号分子调控胞内特定基因的表达，进而影响菌、藻的生理活动。菌藻生物膜中的细菌和微藻的信号作用是相互的，一方面，细菌分泌N-基-高丝氨酸内酯（N-3-acyl-homoserine lactones，AHLs）感应信号分子以及特殊化学物质促进和抑制微藻的生理活动；另一方面，微藻能产生一种AHLs类似物信号分子通过与细菌表面的受体蛋白竞争结合，从而降解受体蛋白分子，抑制生物膜的形成；此外，研究发现植物激素，包括生长素、脱落酸、细胞分裂素、乙烯和赤霉素等广泛存在于藻细胞内，作为一种信号分子能调节细菌的生理，还能作为微藻的胞外信号物质介导微藻间的通讯进而影响微藻生长、胞内生物质合成和抗氧化机制等功能。有研究表明，藻类在老化过程中通过释放出衰老信号来诱导细菌分泌芥子酸、阿魏酸和肉桂酸等化学物质促使藻类溶解。

目前，关于藻-菌之间信号分子作用机理的研究主要集中在革兰氏阴性菌分泌的AHLs对微藻路径基因表达调控，微藻对AHLs信号分子的感知和响应主要通过3种潜在机制：第一种，细菌分泌的AHLs以自由扩散和转运机制的方式进入微藻细胞内部，与胞内特异性受体结合，启动特异性功能基因的表达；第二种，AHLs作为一种胞外信号分子，与微藻细胞膜表面偶联的受体蛋白结合，将信号传导为胞内第二信使分子，调控下游级联反应；第三种，胞内AHLs及转导后的第二信使分子通过调控胞内酶活性、三羧酸循环、氨基酸合成或糖酵解等代谢路径，从而促使藻-菌聚集体的形成。除此之外，研究者对于微藻内源植物激素的研究大都是基于对高等植物激素的认知，而关于植物激素的介导微藻间的通讯与机制的研究尚不清楚，还需进一步研究。

三、菌藻生物膜反应器在畜禽养殖污水的应用效果

1.菌藻生物膜反应器去除养殖污水中营养物质的应用。根据《第二次全国污染源普查公报》统计，2017年我国畜禽养殖业水污染物排放量化学需氧量1000.53万吨，氨氮11.09万吨，总氮59.63万吨和总磷11.97万吨，分别占全国水污染物排放总量的46.67%、11.51%、19.61%和37.95%。其中氮磷物质在养殖污水中主要以氨氮和各类磷酸根离子的形式存在。当水中氨氮浓度过高时，对微藻的生长产生抑制，此时，细菌能将氨氮转化为亚硝态氮和硝态氮等无机氮形式，以降低高氨氮环境对微藻的抑制。养殖污水中的氨氮优先被藻类同化吸收为一种无机氮，接着被转化为氨基酸，释放出O2并且藻细胞直接吸收废水中磷酸盐在有氧条件下通过磷酸化途径转化为ATP，磷脂等。同时，在有氧条件下，好氧细菌将COD氧化分解为CO2，NH4+-N被硝化细菌吸收入细胞体内被电子受体氧化，聚磷菌以糖酵解途径超量吸收污水中无机磷合成聚-β-羟丁酸。污水中磷酸盐形成在无氧条件下以沉淀的方式去除污水中的氮磷元素。

近年来，利用菌藻生物膜系统去除畜禽养殖污水污染物的研究引起了国内外研究学者的关注，并在畜禽养殖污水中营养物质去除方面取得了一些成效。de Godos等将菌藻共生系统形成固定化生物膜后，处理含有656毫克/升氨氮和117毫克/升总磷的生猪污水，发现可进一步提高氮、磷的去除率至90%以上。Gong等对牛粪厌氧发酵液利用膜曝气生物膜反应器进行处理，发现COD的去除效率最高能达到90%以上。González等、Godos等由小球藻活性污泥形成的菌藻共生生物膜反应器对对猪场废水的TN、TP去除效果分别可达94%以上及70%～90%。张正红等利用一种由活性污泥、光合细菌和小球藻组成的菌藻共生序批式生物膜反应器处理具有高浓度污染物的养猪场沼液。张正红等采用活性污泥、光合细菌和小球藻组成的菌藻共生序批式生物膜反应器对猪场沼液中的COD、NH4+-N、TN和TP的去除率分别为92.16%±0.82%、97.98%±0.53%、87.95%±0.55%和84.25%±0.45%。Sun等采用菌藻膜生物反应器处理畜禽污水后发现，微藻能改善微生物活性和污泥特性，且共生系统的污染物去除效率要优于对活性污泥和微藻的单独固定化处理。最新研究发现，采用植物与菌藻生物膜形成的复合生态系统能有效去除污水的营养物质。

2.菌藻生物膜反应器在畜禽养殖污水中降解重金属应用。畜禽养殖饲养中添加的铜、锌等重金属含量往往超过畜禽的吸收能力，大部分随着粪便被排出体外，因此，畜禽养殖污水中残留着大量的Pb2+、Cu2+、Cr6+、Zn2+等重金属离子。菌藻生物膜主要利用菌藻的吸附、沉淀、胞内富集方式来去除污水中的重金属离子。污水中的重金属离子与细菌细胞壁以及EPS上含有的官能团通过离子交换和相互吸附结合而被去除。细胞在重金属离子的刺激下，会增加EPS的分泌，从而促使EPS与重金属离子的作用。菌藻生物膜系统中部分微生物产生能与重金属结合的硫化和磷酸盐代谢物，以沉淀的形式去除环境中的重金属。菌藻生物膜的胞内富集是将吸附在微生物表面的重金属离子通过主动转运和胞吞作用转入到细胞体内，在微藻和细菌体内发生生物富集。

聂国朝等利用藻菌生物膜工艺去除污染水体的重金属，研究表明，藻菌生物膜在一定程度上收到Cd抑制，且丝藻所分泌的EPS为共生菌类和藻类提供一个缓冲Cd毒性的微环境，使得藻菌生物膜能在毒性的环境中保持一定的活性进而能持续有效地去除污染水体中的Cd。Jaafari等利用小球藻和细菌光生物膜反应器处理稀释10倍后猪场废水，其中Zn的去除率达到83.2%。高敏等研究发现污水中重金属离子在低浓度下，生物膜分泌的多聚糖与水中镉离子去除率呈正相关，重金属去除率高。目前，菌藻生物膜反应器主要集中在菌藻对重金属机理的研究，而对畜禽养殖污水中重金属去除应用研究方面比较少，其原因可能有以下两方面：一是养殖场沿用传统的设备，更换设备困难；二是菌藻生物膜反应器起步晚，尤其在畜禽养殖污水重金属离子去除方面还不够成熟。

3.菌藻生物膜反应器去除养殖污水中抗生素的应用。兽用抗生素因其具有促进动物生长和预防动物疾病等作用在畜禽养殖中广泛使用。我国每年约8万吨抗生素被应用于畜牧养殖，占全国总抗生素用量的52%。其中四环素类抗生素是畜禽养殖业中使用量最大的抗菌药物，约占兽用抗生素总用量的57%。养殖中使用的大多数抗生素很难被机体完全代谢吸收，约有40%～90%的兽用抗生素以原体或代谢物形式随粪尿排出。因此，有效处理养殖粪便对降低抗生素的排放至关重要。近年来，将具有降解抗生素的能力的藻类与细菌结合对整个系统的抗生素耐受性有所提高。López-Serna等研究了由微藻-细菌和紫色光合细菌组成的开放式光生物反应器对猪场废水中19种兽药的去除效果，发现菌-藻光生物反应器对土霉素、马波沙星、多西环素、磺胺二甲嘧啶等大多数抗生素的去除效率都高于光合细菌系统。García等利用菌藻光生物反应器对养殖污水中的多西环素和土霉素的去除效率分为95.3%和93.3%。除此之外，Xiong等研究发现当四环素浓度上升至20毫克/升时，微藻-细菌光生物反应器对磷的去除率和部分菌藻生物量的积累量减弱，这表明，高浓度的抗生素影响菌藻系统中微生物结构以及对污染物的去除效率。由此可见，菌藻系统对污水中抗生素处理受一定浓度的影响，对于菌藻联合处理污水中抗生素的机理还需进一步深入研究。而污水中的抗生素能够抑制菌藻生物膜中的细菌生长繁殖代谢，因此菌藻生物膜中进行耐药菌株筛选应用于处理畜禽养殖污水也是亟待解决的问题。

四、总结与展望

菌藻生物膜作为一种绿色的养殖污水处理技术，能够去除畜禽养殖污水中的化学需氧量、氮磷、重金素和抗生素等污染物。虽然菌藻生物膜被国内外学者在畜禽养殖污水中进行了一定的研究，但是将菌藻生物膜在畜禽养殖污水中进行规模化应用还需进一步提升。首先，菌藻生物膜受多重因素作用机制的研究尚不清楚，还需借助现代技术手段进行深入研究，以提高菌藻生物膜在实际养殖污水中的形成速度，减少环境中不利因素对其的阻碍；其次，畜禽污染物成分不同，应筛选不同的菌藻进行培育和优化，稳定而高效的处理极端环境中的有毒养殖污水；最后，菌藻之间信号调控路径研究还需利用转录组学和代谢组学等手段进一步研究。