不同浓度黄芩苷对高毒力肺炎克雷伯菌生长及生物被膜形成能力影响的初步探讨

韩佳慧 刘唐娟 罗劲 黄海珠 陈一强

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)是临床上重要的条件致病菌，主要分为经典肺炎克雷伯菌(clinical Klebsiella pneumoniae , cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae , hvKp)，hvKp能够在年轻的健康宿主中引起严重的、危及生命的社区获得性感染，包括肝脓肿、肺炎、脑膜炎和眼内炎等[1-2]。hvKp可在医疗植入物或组织表面形成生物被膜，从而增强对宿主防御因子和抗菌药物的抵抗能力[2]。生物被膜的形成常导致慢性、难治性的感染，为临床治疗带来了巨大挑战，使得寻找新型有效的抗菌药物成为一个研究热点。本研究拟探讨黄芩苷对hvKp生长及生物被膜形成能力的干预作用，以期为开发新型抗菌药物提供一定的理论依据。

资料与方法

一、试验材料

1 菌株

收集2019年10月-2021年2月于我院临床微生物检验鉴定中心鉴定的Kp。目前，关于hvKp的定义尚无统一标准，本研究根据拉丝试验阳性结果伴有临床侵袭性表现来定义hvKp，根据此方法从收集的临床菌株中筛选出编号为hvKp3的实验菌株，以Kp ATCC43816作为质控菌株。(拉丝试验[3]：用接种环轻触琼脂平板上的菌落，若有黏液丝且拉丝长度>5mm，即为拉丝试验阳性。)

2 主要试剂

黄芩苷粉剂购自成都麦德生科技有限公司，MHA培养基、MHB培养基、二甲基亚砜、结晶紫均为北京索莱宝科技有限公司。

二、仪器与设备

生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)，T6新世纪紫外分光光度计，THZ-82振荡器(常州智博瑞仪器制造有限公司),VARIOSKAN LUX酶标仪(德国Thermo Fish有限公司)。

三、实验方法

1 菌悬液制备

挑取hvKp3单个菌落接种到5 mLMHB培养基中，于37℃恒温水浴摇床中培养16～18h。用紫外分光光度计将过夜培养的菌液调至为OD600=0.1(约3×108cfu/mL)的菌悬液。

2 最低抑菌浓度(MIC)的测定

采用肉汤微量稀释法测定黄芩苷对hvKp3的MIC，ATCC 43816作为质量控制。MIC定义为通过肉眼直接观察，无细菌生长的最低药物浓度。

3 细菌动态生长曲线的测定

取500μL上述菌悬液加入24孔板中，同时加入500μL黄芩苷药液，使各组药液终浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC,以不加黄芩苷的MHB培养基作为空白对照组，37℃、220 r/min恒温水浴摇床中培养，每隔2h用酶标仪测定培养液600nm处吸光度(OD)值, 每组设置3个复孔，连续观察24h，绘制细菌生长曲线。

4 抑菌率曲线的测定

取500μL上述菌悬液加入48孔板各孔中，然后再分别加入500μL黄芩苷药液，使各组药液终浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，同时以不添加黄芩苷的MHB培养基作为阳性对照，以不含菌液的MHB培养基作为阴性对照，每组作3个复孔。于 37℃恒温培养箱中过夜培养，用酶标仪检测波长 600 nm下各孔内液体的吸光度值(OD)，并计算各组的抑菌率。 抑菌率计算公式如下：抑菌率%=(ODr-OD/ODr-ODb)×100%。式中：ODr：阳性对照组的吸光值，ODb：阴性对照组的吸光值，OD：黄芩苷组的吸光值。分别统计黄芩苷的抑菌率，并绘制抑菌率曲线。

5 抑制生物被膜形成实验

取500μL上述菌悬液加入48孔板中，并分别加入500 μL黄芩苷药液，使各组药液终浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，以不加黄芩苷的MHB培养基作为空白对照组，每组做3个复孔；37℃恒温培养箱静止培养24h后，行结晶紫半定量生物被膜形成及生物被膜内活菌菌落计数。

以上试验均独立重复3次。

四、统计分析

结 果

一、MIC的测定结果

黄芩苷对hvKp3、ATCC43816的MIC均为2048 μg/mL。

二、黄芩苷对hvKp3体外生长的影响

1 黄芩苷对hvKp3生长曲线的影响

采用24h细菌动态生长曲线法，研究1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四种不同质量浓度的黄芩苷对hvKp3生长的影响，以MHB培养基作为空白对照，试验结果(见图1)。如图所示，四种不同质量浓度的黄芩苷均可减缓细菌的生长速度，具有明显的抑菌作用。

图1 黄芩苷对hvKp3生长的影响

2 黄芩苷对hvKp3的抑菌试验

采用抑菌率曲线测定的方法，研究1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四种不同质量浓度的黄芩苷对高毒力肺炎克雷菌体外生长的影响，试验结果(见图2)。黄芩苷对hvKp3的抑菌率随其浓度增加而加大。

图2 黄芩苷对hvKp3抑菌率的作用

三、黄芩苷对hvKp3生物被膜的抑制作用

1 结晶紫半定量生物被膜形成

采用结晶紫染色法研究了 1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四种不同质量浓度的黄芩苷对hvKp3生物被膜形成的影响，以MHB培养基作为空白对照，试验结果(见图3、表1)。在终浓度为MIC、1/2MIC、1/4MIC的黄芩苷作用下，hvKp3形成生物被膜的能力得到明显抑制，与空白对照组相比，差异具有显著性(P<0.05), 而终浓度为1/8MIC的黄芩苷对hvKp3生物被膜的形成无明显抑制作用(P>0.05)。

表1 结晶紫半定量吸光值

图3 结晶紫半定量hvKp3生物被膜量

2 生物被膜内活菌菌落计数

采用连续稀释涂布平板法研究了 1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四种不同质量浓度的黄芩苷对hvKp3生物被膜内活菌计数的影响，以MHB培养基作为空白对照，试验结果(见图4、表2)。终浓度为MIC、1/2MIC、1/4MIC的黄芩苷可以有效抑制hvKp3生物被膜内活菌的生长, 与空白对照组比较差异具有显著性 (P<0.05) , 而终浓度为1/8MIC的黄芩苷组与空白对照组相比差异无显著性 (P>0.05) 。

图4 hvKp3生物被膜内菌落计数

表2 生物被膜活菌计数(cfu/mL)

讨 论

hvKp最早发现于1986年的一次临床调查中，该调查报告了台湾7例侵袭性肺炎克雷伯菌感染病例，患者主要表现为肝脓肿和感染性眼内炎，一些患者还伴有其他感染综合征，如肺栓塞、化脓性脑膜炎或前列腺脓肿[4]。1989年，其它国家也报告了类似的案例[5]。有研究表明hvKp可能取代cKp成为全球医院和医疗保健相关的主要致病类型[3]。关于hvKp的定义尚无统一标准，目前无精确的方法来区分hvKp和cKp，多以高黏液表型作为高毒力的标志，故本研究根据拉丝试验阳性结果伴临床侵袭性表现从收集的Kp临床菌株中筛选hvKp菌株。

生物被膜形成是hvKp重要的毒力因子，是hvKp产生多要耐药的主要原因之一。细菌生物被膜的形成是一个复杂过程，主要分为初始粘附阶段、早期生物被膜形成阶段、生物被膜成熟阶段、扩散与再定植阶段，生物被膜的形成为细菌提供了有利于生存的惰性环境，赋予了细菌固有的抗生素抗性，为临床上治疗生物被膜相关感染带来了巨大的困难[6]。越来越多的研究表明，中草药在调节生物被膜形成方面具有抗菌和化学预防作用，可以为生物被膜相关感染的治疗提供新的策略[7]。

黄芩始载于《神农本草经》，为唇形科植物黄芩的干燥根，中医临床和中成药中常用的中药之一[8]。黄芩的主要药效物质基础为黄芩苷，具有抗炎、抑菌、降压、清热解毒、利胆、利尿、抗变态、抗肿瘤、调节免疫、减轻组织的缺血再灌注损伤以及促进细胞凋亡等多方面的作用，尤以抑菌作用最为显著[9]。众多研究表明，黄芩苷可以调节细菌群体感应系统并抑制细菌生物被膜的形成[10-12]。本课题组前期研究已证明黄芩苷能抑制铜绿假单胞菌生物被膜及金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，并且可以增加抗生素对生物被膜的破坏和清除能力[13-15]。

在此基础上，本研究主要探讨黄芩苷对hvKp生长及生物被膜形成能力的作用。研究结果表明，在2048 μg/mL、1024 μg/mL、512 μg/mL的黄芩苷作用下，细菌生长速度明显减慢，同时生物被膜量及生物被膜内活菌计数均少于空白对照组；但是当黄芩苷终浓度为256 μg/mL时，虽然可减慢浮游菌生长，但不能抑制生物被膜的形成，256 μg/mL的黄芩苷作用下，hvKp生物被膜量及生物被膜内活菌计数与空白对照组相比无明显差异。我们推测当黄芩苷浓度≥512 μg/mL时，能够渗入到细菌生物被膜深层结构中，抑制生物被膜内活菌的生长，降低hvKp的黏附作用，进而抑制了hvKp生物被膜的形成与成熟，而低于该浓度的黄芩苷，则不能抑制生物被膜的形成。