一株菌草根际细菌的鉴定及其生物学特性研究

吕正阳，许钰滢，吴凤娟，刘 娟，汪银平，邵登科，翁志强，王荣波，鲁国东1,，叶文雨1,*

(1.国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002；2.植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室，福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物监测与治理重点实验室，福建 福州 350013)

巨菌草(PennisetumgiganteumJUJUNCAO)是一种由福建农林大学林占熺教授从非洲引进选育的一种草本植物。巨菌草具有饲养畜禽、栽培食用菌、防风固沙、发展生物能源、造纸等用途[1-6]。

PGPR(plant growth promoting rhizobacteria)指的是能够促进植物生长的根际细菌。众多研究结果表明，根际范围内是微生物群落中的微生物种类和数目远远大于非根际土壤微生物[7-9]。促生细菌有着促进植物生长、增加作物产量等作用。PGPR按作用机理可分为两大类，一类是直接作用，如解磷固氮产生铁载体等[10-12]；另一类是间接作用，如对病原菌有抑制作用，从而提高作物的抗病性。本试验由土壤微生物中筛选一株对稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、香蕉枯萎病菌1号、香蕉枯萎病菌4号均有作用的菌株，并研究其生理生化特性和促生能力。

磷元素是植物正常生长发育所必需的微量元素之一，具有解磷能力的微生物可以将土壤中难溶态磷转化为可溶态磷，帮助植物更好吸收土壤中磷元素，是最常见的限制作物生长的矿质元素之一，具有促生作用[11，13]。固氮微生物可将氮气转化为生物可利用活性氮，可减少氮肥使用，促进植物生长[12]。能够产铁载体的细菌对植物具有促生作用，因为土壤中的铁以三价铁离子和不溶性氧化态为主，可溶性的二价铁离子含量很少，而铁是植物的生长发育过程中的一个重要微量元素[10]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

供试菌株：该菌株由福建省平潭市长江澳菌草防风治沙基地巨菌草根系土壤中分离出。

供试病原菌：分别为稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense，Foc)引起的香蕉枯萎病中，‘热带1号’生理小种(Foctropical race 1，FocTR1)以下简称香蕉枯萎病菌1号；‘热带4号’生理小种(Foctropical race 4，FocTR4)以下简称香蕉枯萎病菌4号，均保存在植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室。

1.1.2 主要试剂、仪器

有机磷细菌培养基、无机磷培养基、血液琼脂基础、CAS检测培养基、硅酸盐细菌培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)；生化培养箱(宁波海螺赛福实验仪器厂)；UNIQUE-R20 纯水机(锐思捷科学仪器有限公司)；超净工作台ZHJH-C1214B(厦门德维科技有限公司)等。

1.1.3 培养基配方

LB固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2)，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)，血液琼脂培养基(现配血液琼脂基础，胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g、氯化钠5.0g、琼脂13g，蒸馏水1000ml，pH 7.2-7.4，高压灭菌后，冷却至50-55℃时无菌操作加入5%-10%预温至37℃的无菌脱纤维羊血，混匀)，淀粉水解培养基(可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，牛肉粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)，明胶培养基(蛋白胨5g，明胶150g，蒸馏水1000ml，pH 7.2-7.4)，脱脂奶粉培养基(脱脂奶粉20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)，有机磷细菌培养基(葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸钙1.0g，琼脂15.0g，pH 7.0-7.5)，无机磷培养基(葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸三钙5.0g，pH 7.0-7.5)，Ashby培养基(甘露醇10.0g，磷酸二氢钾0.2g，七水合硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，二水合硫酸钙0.1g，碳酸钙5.0g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH 7)，CAS检测培养基(CAS检测培养基10.87g，加热煮沸完全溶解于1000ml水中，高压灭菌后，冷却至50-55℃时无菌操作每100ml加入3ml无菌水解酪蛋白溶液和1ml无菌 20%葡萄糖)，硅酸盐细菌培养基(蔗糖5.0g，硫酸镁0.5g，硫酸钙0.1g，磷酸氢二钠2.0g，氯化铁0.005g，玻璃粉1.0g，琼脂15.0g，pH 6.8-7.2)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离与纯化

称取10g新鲜巨菌草根际土壤，加入盛有100mL，0.85%NaCl生理盐水的无菌三角瓶中，摇床180rpm，振荡30min，取出后冰浴静置2min，取上清液用0.85% NaCl溶液梯度稀释，分别取稀释100倍、1000倍、10000倍三种梯度稀释液100ul涂于LB平板上。挑取单菌落纯化3次后保菌备用。

1.2.2 拮抗菌株的筛选

本文采用平板对峙法分别进行拮抗菌株的筛选，将稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌1号、香蕉枯萎病菌4号、禾谷镰刀菌四种病原菌各打成直径5mm的菌饼，接种于90mmPDA培养基平板中间。在两侧用细菌画一条线，待对照组菌株快长满时，用十字交叉法测量病原菌菌落直径。其抑菌率(%)=(对照病原菌菌落直径-平板对峙病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径×100%[14-15]。

1.2.3 形态鉴定

将菌株在LB固体培养基上划线培养，37℃培养24h后，观察其菌落特征。

1.2.4 分子鉴定

活化菌株，以菌液为模板，用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′)，1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC TTCA CCCC-3′)进行16S-rRNA基因序列进行PCR扩增。25ul反应体系包括Reaction Mix(购于TIANGEN公司)12.5ul，27F，1492R各1ul，模板1ul，并用ddH2O补齐至25ul。PCR 扩增条件:94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，共设30个循环；最后 72℃延伸5min。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将所得序列在NCBI 网站上进行BLAST序列对比，使用MegaX软件采用最大似然(Maximum Likelihood)法，并通过自举分析(boostrap)进行置信度检测，自举数据集为1000次，构建系统发育树。

1.2.5 生理生化特性鉴定

溶血试验：将细菌接种于血琼脂培养基中间，37℃，培养24h，若菌落边缘产生透明圈，则为β型溶血，若菌落边缘培养基变绿，则为α型溶血，若无，则为γ型溶血[16]。

淀粉水解酶试验：将细菌接种于淀粉水解培养基中间，28℃，暗箱培养3d后，均匀滴加碘液至平板上，观察菌落边缘出现水解圈则为阳性，若无则为阴性。

明胶液化试验：在2.0ml EP管中加入1.5ml明胶培养基，并穿刺接种细菌。28℃，暗箱培养5d后，将EP管置于4℃冰箱，1h后观察拍照，若培养基液化则为阳性反应，若培养基无液化则为阴性反应。

蛋白酶试验：将细菌接种于脱脂奶粉培养基中间，28℃，暗箱培养3d，若菌落边缘产生透明圈，则为阳性，若无透明圈产生，则为阴性[17]。

1.2.6 促生潜力研究

溶磷能力鉴定：分别在有机磷、无机磷培养基上滴加菌液，28℃暗箱培养8d后，观察菌落周围是否有透明圈[18]。

固氮能力鉴定：活化菌液，以1∶50比例加入Ashby液体培养基中，28℃，静置培养7d，若液体浑浊则认为有固氮活性。挑取固氮活性菌株在Ashby固体培养基上连续传代3次后，若仍然有固氮活性则视为菌株具有稳定固氮活性。

合成铁载体能力鉴定:将菌株接种于 CAS 检测培养基，于28℃恒温培养5d，观察菌落周围是否出现黄色晕圈，若出现黄色晕圈，表明细菌能够产生铁载体，如未出现，则表明细菌不能产生铁载体[19-20]。

解硅酸盐能力鉴定：将菌液涂布于硅酸盐培养基上，28℃培养4d后，若细菌能在培养基上生长，则表明该细菌有解硅酸盐能力。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的筛选

菌株PT-140拮抗四种病原真菌的试验结果表明，该菌对稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、香蕉枯萎病菌1号和香蕉枯萎病菌4号四种病原真菌均具有一定程度的抑菌作用(图1)，抑菌率在11.67%-34.56%之间(图2)。

图1 PDA平板上PT-140对不同病原菌的拮抗作用

注：Guy11:稻瘟病菌；PH-1：禾谷镰刀菌；Foc1:香蕉枯萎病菌1号；Foc4:香蕉枯萎病菌4号。图2 菌株对不同病原真菌的抑制率

2.2 菌株的形态学鉴定

菌株PT-140菌落形态特征为菌落边缘整齐，淡黄色，表面光滑，小凸起(图3)。

图3 菌株PT-140的菌落形态特征

2.3 菌株的分子鉴定

基于16S rDNA基因序列，利用MegaX软件采用最大似然法构建系统发育树。(图4)结果显示,菌株PT-140与产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes，KF928775.1)聚在同一分支且16SrDNA序列同源性> 99%，亲源关系最近。可初步判断该PT-140菌株为产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)。

图4 基于16S rRNA序列构建PT-140的系统发育树

2.4 菌株的生理生化特性

从图5A可以看出，将PT-140菌株点种于溶血平板上培养，菌落周围培养基基质变绿色，表明PT-140菌株为α型溶血，具有条件致病性；从图5B可以看出，将PT-140菌株接种于淀粉水解培养基上培养，没有产生水解圈，表明PT-140菌株不具备溶解淀粉的能力，在淀粉水解酶试验中为阴性。从图5C可以看出，将PT-140菌株穿刺接种于明胶培养基中，结果为阴性，说明该菌不具有明胶酶。从图5D可以看出，菌株PT-140在蛋白酶试验中结果为阴性，说明该菌不能够产生蛋白合成酶。

图5 菌株PT-140的生理生化特性

2.5 菌株的促生能力鉴定

如图6A、6B所示，菌株PT-140在有机磷培养基、无机磷培养基中有明显透明圈产生，说明菌株PT-140具有溶解磷的能力。同时，菌株PT-140在Ashby液体培养基(图6C)中静置培养7d后无明显浑浊，说明菌株固氮能力不强；菌株在CAS培养基(图6D)上培养后，有透明圈产生，说明菌株PT-140具有铁载体的生产潜力；菌株PT-140在硅酸盐培养基中生长缓慢(图6E)，可能具有较弱的解硅酸盐能力。

图6 菌株PT-140的促生潜力研究

3 讨论

菌草是可培养食用菌和药用菌的草本植物。菌草根系发达，具有抗干旱、防风固沙、耐盐碱等能力。前期研究表明，菌草根际土壤微生物具有多样性。PGPR是环境友好型微生物，绿色环保，越来越受到人们关注。本试验从巨菌草根际土壤中分离了一株根际细菌PT-140，鉴定为产气大肠杆菌(Enterobacteraerogenes)。

平板对峙实验结果表明，PT-140对稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、香蕉枯萎病菌1号和香蕉枯萎病菌4号四种病原真菌均有一定的抑菌能力，对稻瘟病菌的抑菌率最大为34.56%，对香蕉枯萎病菌4号的抑菌率最小为11.67%。生理生化的试验结果表明，溶血试验α型、淀粉水解试验、明胶液化试验、蛋白酶试验均为阴性。该菌株具有较强的溶磷和产铁载体能力，而固氮、解硅酸盐能力相对较弱。

综上表明：产气大肠杆菌PT-140具有一定促进植物生长和防治病原真菌的潜能，对多种作物促生和病害也具有很好的防治前景，因此有望开发为微生物制剂。后续应对产气大肠杆菌PT-140进行进一步的深入探索，了解其促生和抗菌机制，优化其发酵条件，得到较高活性的促生和生防菌剂，应用于大田试验。