低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度结球甘蓝幼苗的影响

常 振，邓昌蓉,2，张彦君，刘 敏，邵登魁,2*

(1.青海大学农林科学院，青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，青海 西宁 810016;2.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016)

结球甘蓝(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)简称甘蓝，是由不结球野生甘蓝进化而来的两年生十字花科芸薹属作物，十六世纪开始由地中海沿岸传入我国。因其抗逆性强、易栽培、耐运输等特点，迅速在全国范围广泛种植，是我国仅次于白菜的主栽蔬菜[1]。野生结球甘蓝的叶片表面有一层灰绿色的蜡质覆盖，结球甘蓝蜡质缺失突变体叶片表现为无蜡或少蜡，叶片光亮油绿，具有较好的商品性。研究发现蜡质是植物排出细胞外的长链脂肪酸、烷烃、烯烃、醇类和醛类等多种化合物的集合，也是表皮细胞与外界环境直接接触的主要构成物质，是植物表皮细胞外层最主要的保护性屏障[2]。

研究表明十字花科植物在低温胁迫[3]、水分胁迫[4]、紫外线胁迫[5]、干旱胁迫[6]等环境下，植物叶片表皮蜡质化程度均会提升，来抵御逆境。青海省属大陆性高原半干旱气候，适宜露地蔬菜生长的区域年平均气温3.4℃-9.6℃，叶类蔬菜的种植周期短，早春低温环境严重制约结球甘蓝种植面积的扩大，低温胁迫会导致甘蓝生长缓慢、生活力降低。植物内部会启动一系列响应机制来响应低温环境，前人研究发现低温胁迫下羽衣甘蓝[7]、小白菜[8]、甜菜[9]等叶片内相对含水量、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)、脯氨酸、抗氧化酶活性等均显著增加，葛君等[10]研究发现低温胁迫对小麦叶片光合色素含量有显著影响。前人研究还发现蜡质与植物对温度的适应相关，有蜡质覆盖的柑橘、葡萄均比无蜡质覆盖的柑橘、葡萄有更强的耐低温性[11-12]。目前关于结球甘蓝叶面蜡质与低温耐性的关系尚不明确，本研究以2份不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝为试验材料，旨在探讨低温对不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝的影响，有助于进一步解析结球甘蓝叶面蜡质与低温互作机制，从而对后续结球甘蓝的抗低温性机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及低温处理

本试验选取的厚蜡质材料HQ2-1与蜡质缺失突变体Y2-1两份材料均来源于青海省农林科学院园艺研究所。待2份材料幼苗长至两叶一心时，选取长势一致的幼苗移至人工气候箱中进行低温处理，低温环境为昼温10℃，夜温5℃，光照时间14h/d，光照强度12000Lx，空气相对湿度 70%；对照处理温度为昼温20℃，夜温10℃，其它条件均一致。以第3片真叶完全展开、第4片真叶刚长出时为标准，取长势整齐的幼苗第3片真叶进行各生理生化指标测定。

1.2 测定指标与方法

每处理随机选取3株结球甘蓝幼苗，以结球甘蓝幼苗最外层的第3片真叶为试材，测叶长、叶宽、叶柄长、叶柄重、叶全鲜重、叶全干重，求平均值。相对水含量参照王玉贤[13]的方法测定，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量参照李合生[14]的方法测定，丙二醛(MDA)含量参照王学奎[15]的方法测定，游离脯氨酸含量参照孔祥生[16]的方法测定，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化物酶活性参照王学奎[17]的方法测定，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素、类胡萝卜素等光合色素含量测定参照葛君[10]的方法测定。每个测定指标3次生物学重复。

1.3 数据处理

本试验采用软件SPSS 20.0和 Microsoft Excel 2010 对数据进行统计和分析，数据差异的显著性采用 Duncan 新复极差法进行估算。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗生长特性的影响

试验结果(图1、图2)显示，低温胁迫下HQ2-1和Y2-1的叶片生长相比于各自对照明显受到抑制，叶片偏小；由表1可知，低温胁迫下HQ2-1与Y2-1叶长分别比对照减少26.65%、39.58%，叶宽分别比对照减少16.83%、35.03%，均差异显著；低温胁迫下HQ2-1叶柄长降低23.18%，降幅低于Y2-1的26.67%，叶柄重均无显著差异；低温胁迫下HQ2-1叶片相对含水量显著下降3.57%，低于Y2-1的4.19%降幅。结果表明低温胁迫下2份材料叶片生长均受到明显抑制，其中HQ2-1的叶片生长的受抑制程度及相对含水量的下降幅度均小于Y2-1。

注：图中CK表示常温对照，LT表示低温胁迫；下图同。Note:In the figue,CK is normal temperature control,LT is low temperature stress;The following figue with.图1 HQ2-1叶表面与Y2-1叶表面Figue.1 Leaf surfaces of HQ2-1 and Y2-1

图2 HQ2-1叶背面，Y2-1叶背面Figue.2 HQ2-1 leaf abaxial，Y2-1 leaf abaxial

表1 低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗叶片生长指标的影响Table.1 Effects of low temperature stress on leaf growth indexes of Cabbage seedlings with different wax coverage

2.2 低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响

从图3可知，受低温胁迫后HQ2-1与Y2-1的可溶性糖含量分别比对照上升173.58%、148.64%，均差异显著，且HQ2-1增幅显著高于Y2-1。可溶性蛋白含量是植物耐低温性的重要指标，耐低温能力越强可溶性蛋白含量越高，低温胁迫下HQ2-1与Y2-1的可溶性蛋白含量较各自对照均显著增加，HQ2-1增加20.27%，显著高于Y2-1的14.49%的增幅。结果表明低温胁迫下HQ2-1叶片的可溶性糖及可溶性蛋白的增加量均显著高于Y2-1。

注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下图同。Note:Different lowercase letters in the figure indicate significant difference (P<0.05)，same as below.图3 低温胁迫对不同蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响Figure.3 Effects of low temperature stress on soluble sugar and soluble protein contents of Cabbage seedlings with different wax coverage

2.3 低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗MDA含量和游离脯氨酸含量的影响

从图4可知，对照处理下HQ2-1与Y2-1叶片中MDA含量和游离脯氨酸含量均无明显差异。经低温胁迫处理后，HQ2-1与Y2-1叶片中MDA 含量较各自对照均显著升高，方差分析结果显示，低温处理的两个材料间MDA 含量水平接近，无显著差异；游离脯氨酸可进行渗透调节来提高植物耐低温性，低温胁迫下2份材料中游离脯氨酸含量均显著增加，HQ2-1增幅显著高于Y2-1。结果表明低温胁迫下HQ2-1比Y2-1的叶片细胞膜透性受到的损伤较轻。

图4 低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗MDA 含量、游离脯氨酸含量的影响Figue.4 Effects of low temperature stress on MDA content and free proline content of Cabbage seedlings with different wax coverage

2.4 低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度结球甘蓝幼苗抗氧化物酶活性的影响

从图5可知，低温胁迫下2份不同蜡质覆盖度的材料幼苗的SOD、POD、CAT及APX等抗氧化酶活性较各自对照均明显上升。其中，HQ2-1的 POD、CAT及APX等抗氧化酶活性分别比对照增加了81.43%、127.16%及20.68%，均高于Y2-1的54.61%、42.27%及20.57%；HQ2-1的SOD活性增幅为70.51%，低于Y2-1的82.38%。结果表明低温胁迫下HQ2-1叶片中POD、CAT及APX等抗氧化酶活性均高于Y2-1。

图5 低温胁迫对不同蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗抗氧化酶活性的影响Figue.5 Effects of low temperature stress on antioxidant enzyme activities in Cabbage seedlings with different wax coverage

2.5 低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗光合色素的影响

叶绿体作为植物细胞能量代谢的场所，光合色素参与吸收、传递光能等环节。本研究通过测定低温处理下结球甘蓝幼苗叶绿素a、叶绿素b、叶绿素、类胡萝卜素等光合色素来说明低温对光合系统的影响。从图6可知，无论常温对照还是低温胁迫，蜡质缺失突变体Y2-1各光合色素含量高于厚蜡质材料HQ2-1，但低温胁迫下HQ2-1与Y2-1叶片的各光合色素含量均被降解，其中Y2-1叶片中叶绿素a、叶绿素及类胡萝卜素光合色素含量较对照分别下降34.53%、14.63%及28.54%，均高于HQ2-1的22.10%、14.48%、25.41%，而Y2-1中叶绿素b含量下降13.11%，低于HQ2-1的35.40%。结果表明Y2-1叶片中的光合色素含量高于HQ2-1，但低温胁迫下Y2-1叶片中除叶绿素b外，叶绿素a、叶绿素及类胡萝卜素等光合色素的含量下降幅度均高于HQ2-1，说明低温胁迫对Y2-1叶片中光合色素降解的影响高于HQ2-1。

图6 低温胁迫对不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝幼苗光合色素含量影响Figue.6 Effects of low temperature stress on photosynthetic pigment content of Cabbage seedlings with different foliar wax coverage

3 讨论与结论

低温是影响植物生长发育的重要非生物胁迫因素，本试验对低温胁迫下2份不同叶面蜡质覆盖度的结球甘蓝幼叶期生长特性及生理生化指标差异进行了比较分析，结果表明低温胁迫下HQ2-1和Y2-1的叶片生长均受到抑制，这与秦文斌在甘蓝幼苗研究结果一致[18]；Y2-1相对含水量下降幅度高于HQ2-1，这可能是由于厚蜡质材料HQ2-1 的表层蜡质屏障可减少水分的散失造成，在后续试验中测定叶片蒸腾速率等指标来验证。前人研究发现，植物体内可溶性糖含量及可溶性蛋白含量均与植物耐低温性成正比，其中可溶性糖一方面维持细胞渗透势，另一方面作为植物呼吸作用的底物，从而增强作物抗冻性；可溶性蛋白多为低温胁迫下参与催化反应的酶，功能上起到调节耐低温基因表达的作用，本试验中低温胁迫下2份材料的可溶性糖及可溶性蛋白含量均显著增加，这与前人研究结果一致[19]，其中HQ2-1可溶性糖及可溶性蛋白含量增幅显著高于Y2-1，说明低温胁迫会引起HQ2-1更多耐低温基因的表达。低温胁迫下2份材料丙二醛(MDA)含量均增加，说明低温胁迫对2份结球甘蓝幼苗的细胞膜均造成了不同程度的损伤，这与朱惠霞等在冬油菜中研究低温胁迫对其的影响一致[20]。游离脯氨酸因含有亚氨基，利于蛋白质水合作用，因此作为渗透调节剂在植物抗逆境环境中起重要作用，游离脯氨酸含量的增加有助于提高作物的耐低温性[21]。本研究中2份材料在低温环境中游离脯氨酸含量均显著积累，HQ2-1累积量明显高于Y2-1，说明低温胁迫下HQ2-1通过积累更多的游离脯氨酸来提高自身耐低温性。

低温胁迫使植物叶片中碳同化和电子传递链受到抑制，导致细胞膜过氧化损伤及丙二醛外渗，细胞内活性氧自由基迅速累积后得不到清除，而 SOD、POD 、CAT及APX 是植物抵抗逆境胁迫时在其抗氧化系统中起重要作用的酶，起到清除活性氧自由基的作用，因此植物抗寒性与抗氧化酶的活性呈显著正相关[13]。本研究表明，在低温胁迫下2份材料的抗氧化酶促反应均被激活，APX虽有增加，但差异不显著，HQ2-1的SOD活性增幅低于Y2-1，这与秦文斌等的研究结果相反[18]，可能是由于HQ2-1表皮蜡质层有一定的保温作用，对低温灵敏性较低，影响到SOD活性的变化，后续试验将进一步验证。HQ2-1中POD和CAT等抗氧化酶活性上升幅度均显著高于Y2-1，这与Lee等的研究结果一致[22]，表明HQ2-1的 POD和CAT 等酶活性显著上升对于结球甘蓝耐低温性的增强起重要作用。

植物叶片光合色素含量会影响叶绿素对光能的吸收、电子传递之间的分配，从而影响光合作用，低温胁迫一方面会降低叶绿素合成相关酶的活性，影响叶绿素合成；另一方面会减弱呼吸作用，致使过多的氧自由基破坏叶绿体膜，迫使叶绿素分解，最终影响光合速率[23]。本试验表明Y2-1叶绿素等光合色素含量均高于HQ2-1，这与观察到的Y2-1叶片光亮油绿特点相一致，低温胁迫下2份不同蜡质覆盖度的结球甘蓝材料中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素、类胡萝卜素等光合色素含量均下降，试验结果与葛君研究结论一致[10]，HQ2-1中除叶绿素b含量降幅高于Y2-1外，HQ2-1中叶绿素、叶绿素a和类胡萝卜素等光合色素降幅均低于Y2-1。低温胁迫降低了酶活，进而降低光合色素生物合成速率，导致光合色素含量下降，蜡质缺失突变体Y2-1光合色素降解幅度大于厚蜡质材料HQ2-1，可能是由于低温胁迫导致HQ2-1叶表皮蜡质增厚，一定程度起到保温效果，减缓叶绿素等光合色素降解幅度。

与蜡质缺失突变体Y2-1相比，厚蜡质材料HQ2-1更有效响应低温胁迫，低温胁迫下HQ2-1叶片生长受到抑制程度、相对含水量及光合色素等的降低幅度均小于Y2-1，HQ2-1可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸及抗氧化物酶活性的增幅均高于 Y2-1。综上所述，HQ2-1 在低温环境中通过提高渗透调节能力、减少细胞膜损伤等防止内含物流出；通过增强抗氧化酶活性促进耐低温基因的表达，从而提高低温适应性，进而减缓光合色素的降解。所以，厚蜡质材料HQ2-1比蜡质缺失突变体Y2-1有更强低温适应性。