高效液相色谱法测定1%氯虫·噻虫胺颗粒剂中 杂质3-甲基吡啶

吴艳娇，张 铎，李永娜，邬美男

（北京思农源信息咨询有限公司，北京通州 101149）

氯虫苯甲酰胺是第一个具有新型邻酰胺基苯甲酰胺类化学结构的广谱杀虫剂，由DuPont公司发现并开发。该剂的主要作用机制是激活昆虫兰尼碱受体，使昆虫释放平滑肌和横纹肌细胞内贮存的钙离子，使肌肉调节功能减弱、害虫麻痹，甚至死亡[1]。此物质对鳞翅目、鞘翅目叶甲科、双翅目潜蝇科、烟粉虱等多种害虫的防治效果显著，广泛应用于烟草、水稻和果蔬的害虫防治[2-3]。

3-甲基吡啶又称3-皮考林，是重要的医药、化工原药。欧盟登记规定了氯虫苯甲酰胺原药中3-甲基吡啶为相关杂质，其含量不能高于3 g/kg[4]。我国农业农村部2020年公布了相关杂质清单，其中将3-甲基吡啶列为氯虫苯甲酰胺的相关杂质之一。

国内关于氯虫苯甲酰胺的测定方法报道较多，而关于3-甲基吡啶的测定方法报道较少，目前国内文献中仅有液相色谱法[5]。目前尚未见对氯虫苯甲酰胺中3-甲基吡啶的检测方法的相关报道。 本文建立了氯虫苯甲酰胺制剂中3-甲基吡啶的液相色谱分析方法，满足氯虫苯甲酰胺系列产品质量控制和登记资料需求。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

KH-500型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Aglient 1200型高效液相色谱仪配二极管阵列检测器、四元低压输液泵、脱气机和自动进样器（美国安捷伦公司）。

1.2 试剂与材料

3-甲基吡啶（质量分数99.1 %，阿拉丁试剂上海有限公司）；冰乙酸（分析纯，南京化学试剂厂）；磷酸（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；乙酸铵（色谱纯，阿拉丁试剂上海有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia Company, Inc）；水为二次重蒸水；1%氯虫·噻虫胺颗粒剂由某农药企业提供（氯虫苯甲酰胺含量0.25%）。

1.3 试验方法

1.3.1 高效液相色谱条件

色谱柱为Zorbax EclpisePlus-C18柱 （250 mm × 4.6 mm ID, 5 μm），柱温为30 ℃；流动相为乙腈/冰乙酸-乙酸铵水溶液（1 L水中加入3 g冰乙酸、3.85 g乙酸铵，超声溶解，过0.45 µm滤膜），采用梯度洗脱程序（表1），流速为1.0 mL/min，检测波长为262 nm，进样量为10 μL。在该色谱条件下，3-甲基吡啶的保留时间约为5.5 min。

表1 流动相梯度条件

1.3.2 标准溶液的配制

标准溶液母液：准确称取3-甲基吡啶标样0.038 1 g （精确至0.000 2 g）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。

标准溶液：移取1 mL标准母液，用甲醇稀释至1 000 mL，得到3-甲基吡啶的质量浓度为0.38 mg/L。

1.3.3试样溶液的制备

称取粉碎的1%氯虫·噻虫胺颗粒剂试样5.0 g （精确至0.000 2 g） 于150 mL锥形瓶中，准确加入100 mL甲醇，将样品超声5～10 min溶解完全后，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

1.3.4 测定

在上述色谱操作条件下，待仪器稳定后进2针标准溶液，待2针溶液的峰面积相对变化不大于10%，然后按标准溶液、试样溶液、试样溶液、标准溶液的顺序依次进样。

1.3.5 计算

将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中3-甲基吡啶的峰面积分别进行平均。试样中3-甲基吡啶的质量分数X1（%）按式⑴计算：

式中：A1为标样溶液中3-甲基吡啶的峰面积平均值；A2为试样溶液中3-甲基吡啶的峰面积平均值；m1为标样溶液中3-甲基吡啶的质量，g；m2为试样的质量，g；w为标样中3-甲基吡啶质量分数，%；1 000为标准溶液的稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

由于3-甲基吡啶呈弱酸性，为了使其峰形对称且具有良好的分离度，本文分别采用了乙腈/0.04%磷酸水溶液（5/95，体积比）、乙腈/冰乙酸-乙酸铵水溶液（1 L水中加入3 g冰乙酸和3.85 g乙酸铵） （15/85，体积比）为流动相。

当采用乙腈和0.04%磷酸为流动相时，色谱峰形对称，但保留时间较短，其后面的负峰对其准确定量有一定影响，典型标样色谱图见图1A。当采用乙腈/冰乙酸-乙酸铵水溶液=15/85为流动相时，3-甲基吡啶的保留时间约为5.5 min，色谱峰形对称，分离度良好，典型标样和试样色谱图见1B和图2。从图1B和图2可见，3-甲基吡啶附近无杂质干扰，能满足3-甲基吡啶定量分析要求。

图1 3-甲基吡啶标样的色谱图

图2 试样的色谱图

2.2 检测波长的选择

采集190～400 nm的光谱数据，从3D谱图分析可知，3-甲基吡啶的最大吸收波长为262 nm，因此选择262 nm作为检测波长。在该波长下3-甲基吡啶的灵敏度最高，且无杂质干扰。

2.3 方法的线性关系

移取适量标准母液1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得到3.8 mg/L标准溶液。再用甲醇逐级稀释，得到3-甲基吡啶质量浓度分别为0.095、0.19、0.38、0.76、3.8 mg/L的标准溶液。按1.3.1节色谱操作条件进行测定，每个浓度溶液重复测定3次。以标准溶液的质量浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标，绘制标准曲线（表2）。可见，3-甲基吡啶峰面积与其质量浓度之间表现出良好的线性关系。

表2 3-甲基吡啶的线性方程、线性范围、相关系数

2.4 方法的定量限

在1.3.1节色谱条件下测定3-甲基吡啶标样（0.095 mg/L）。选择3-甲基吡啶色谱峰附近的一段基线作为噪声，利用chemisation软件进行信噪比分析。该浓度下，信噪比为16.9。因此10倍信噪比仪器的定量限为0.056 mg/L。按照1.3.3节中方法配制试样溶液，方法的定量限为1.12 mg/kg。目前国内虽然公布了氯虫苯甲酰胺中的相关杂质，但并未规定杂质限量。根据欧盟登记原药中3-甲基吡啶的限量，含量为0.25%氯虫苯甲酰胺的1%氯虫·噻虫胺颗粒剂中3-甲基吡啶的限量为7.8 mg/kg，方法定量限完全满足3-甲基吡啶的定量要求。

2.5 样品的测定

按1.3.2节配制1%氯虫·噻虫胺颗粒剂试样溶液，分别平行制备5份试样溶液。在1.3.1节色谱条件下检测3-甲基吡啶含量，典型试样色谱图参见图4。可以看出，所有试样中均未检出3-甲基吡啶。

图4 试样中3-甲基吡啶标样的色谱图（未检出）

2.6 方法的准确度

采用添加法，称量试样5.0 g于150 mL锥形瓶中，加入1.0 mL 37.8 mg/L 3-甲基吡啶标准溶液，得到加标试样含量为7.6 mg/kg，再准确加入99.0 mL甲醇，超声5～10 min溶解后，冷却至室温后，过滤。平行制备5个样品，在1.3.1节色谱条件下测定（表3）。可见，3-甲基吡啶的回收率为101.1%～106.6%，平均回收率104.9%，说明该方法的准确度满足痕量组分定量要求。典型的加标试样色谱见图3。

图3 3-甲基吡啶的3D光谱图

表3 方法准确度试验

3 结 论

利用反相高效液相色谱仪建立了一种梯度洗脱测定氯虫苯甲酰胺中杂质3-甲基吡啶的方法。该方法回收率为101.1%～106.6%，所得回归方程线性范围宽（0.095～3.8 mg/L），相关性良好，方法定量限低（1.12 mg/kg），为生产企业的氯虫苯甲酰胺系列产品注册、生产过程质量控制和产品贸易提供了切实可行的分析检测手段。