低温贮藏过程中水牛肉蛋白质的变化

丘 静

秦德丽1，2

刘纯友1,2，3

孙庭广1，2

罗其勇1，2

(1. 广西科技大学生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2. 广西柳州螺蛳粉工程技术研究中心，广西 柳州 545006; 3. 华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070)

水牛(Bubalusbubalis)是一种生长在热带、亚热带地区的特色畜种，是中国黄牛、牦牛和水牛三大牛种中唯一能适应热带、亚热带地区高温高湿极端环境的特殊牛种[1]。亚洲是全球水牛的主产区，占世界水牛种群数量的97% 以上[2]。与普通黄牛肉相比，水牛肉色泽更加鲜红、蛋白质含量高、脂肪和胆固醇含量较低，食用品质比黄牛肉更高[2-3]。

蛋白质是肉类的主要营养成分之一，常温条件下蛋白质很容易发生氧化，进而使蛋白质分子内或分子间发生交联，导致肉类的色泽、嫩度、保水性和质地等食用品质严重下降[4-5]。研究[6-7]表明，蛋白质在低温情况下依然会发生劣变。目前，关于冷藏或冻藏过程中蛋白质氧化研究主要集中于普通黄牛肉[6-8]和牦牛肉[9]，而有关低温贮藏过程中中国沼泽型水牛肉蛋白质变化国内外未见相关文献报道。研究拟以水牛肉为研究对象，分别将其于4，-18，-60 ℃贮藏，通过测定蛋白质含量、表面疏水性、总巯基含量、游离巯基含量及羰基值等蛋白质指标，同时进行指标间的相关性分析，阐明低温贮藏过程中水牛肉蛋白质的变化规律，以期为生鲜水牛肉的贮藏保鲜及肉类品质变化机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水牛肉：背最长肌，广西冠业投资发展有限公司柳州东环分公司；

盐酸胍、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、溴酚蓝、十二烷基磺酸钠、尿素、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、DTNB、氯化钾、EDTA、2,4-二硝基苯肼、盐酸、硫酸等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

紫外—可见分光光度计：UV-2600型，岛津仪器苏州有限公司；

高速冷冻离心机：Avanti J-26 XPI型，美国贝克曼库尔特有限公司；

超低温冰箱：DW-86L386型， 青岛海尔特种电气有限公司；

冰箱：BCD-518WEC型， 中科美菱低温科技有限公司；

电子分析天平：AE2204型，湘仪天平仪器设备有限公司；

pH计：PHS-25CW型，上海般特仪器制造有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-4S型，江苏金怡仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品贮藏方法 将新鲜水牛肉(背最长肌)用刀去除肉眼可见的筋腱、脂肪和结缔组织，将样品切成质量400 g，厚度3 cm的肉块，再将样品用聚乙烯薄膜包裹，随机分成3组，分别于4，-18，-60 ℃贮藏。肉样于冷藏温度(4 ℃)下分别贮藏0，2，4，6，8，10，12 d，于冻藏温度(-18，-60 ℃)下分别贮藏1，5，10，15，20，25，30 d，冷冻样品先用保鲜膜包裹好再用自来水流水方法进行解冻，当肉样中心温度达4 ℃时解冻完毕，测定肉样的蛋白质含量、表面疏水性、总巯基含量、游离巯基含量、羰基值等蛋白质品质指标，每个样品平行3次取平均值。

1.3.2 总蛋白质含量测定 根据GB 5009.5—2016。

1.3.3 表面疏水性测定

(1) 肌原纤维蛋白提取：参照Park等[10]的方法并修改。先将肉样切碎称取5 g，加入20 mL磷酸盐缓冲液(含0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA, 6.1 mmol/L NaH2PO4，3.9 mmol/L Na2HPO4·H2O, pH 7.0)，8 000 r/min均质30 s；4 ℃、3 650 r/min离心15 min，弃去上清液；粗提的肌原纤维沉淀物用4倍体积的磷酸盐缓冲液洗涤2次，再用4倍体积的0.1 mol/L NaCl溶液洗涤3次，并用4层纱布过滤，去除肉样中的结缔组织；用0.1 mol/L的HCl将肌原纤维蛋白溶液的pH值调至6.0，离心，得肌原纤维蛋白备用。

(2) 表面疏水性：参照Chelh等[11]的方法，按式(1)计算溴酚蓝结合量。

(1)

式中：

X——溴酚蓝结合量，μg；

A0——空白对照组在595 nm处的吸光度值；

A1——试验组在595 nm处的吸光度值。

1.3.4 总巯基含量测定 参照周果等[12]的方法。

1.3.5 游离巯基含量测定 采用Rysman等[13]的方法并修改。取1.0 mL 肌原纤维蛋白溶液，加入4.5 mL Tris-HCl 溶液(0.2 mol/L，2.0% SDS，10 mmol/L EDTA，pH 6.8)，混匀，加入1.0 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl 溶液(0.2 mol/L，0.1% DTNB，pH 8.0)，40 ℃水浴25 min，测定412 nm处吸光度值。用0.6 mol/L 的KCl溶液做空白对照。按式(2)计算游离巯基含量。

(2)

式中：

X——游离巯基含量，mol/mg；

D——稀释倍数，为10；

13 600——分子吸光系数；

C——样液的质量浓度，mg/mL。

1.3.6 羰基含量测定 参照马丽华等[14]的方法并修改。称取3.0 g切碎的肉样，加入30 mL Tris-HCl溶液，8 000 r/min 均质30 s，4 000 r/min离心15 min，取1.0 mL 上清液，加入1.0 mL 2,4-二硝基苯肼溶液(0.01 mol/L)混匀，黑暗环境下反应60 min，加入1.0 mL三氯乙酸溶液(20%)，4 000 r/min离心15 min，弃去上清液；沉淀中加入4.0 mL盐酸胍(6.0 mol/L)，37 ℃水浴15 min，5 000 r/min离心10 min，测定370 nm处吸光度值。按式(3)计算羰基含量。

(3)

式中：

X——羰基含量，nmol/mg；

D——稀释倍数；

A370 nm——370 nm处吸光度值；

854——所有醛类吸光系数的平均值，A/mmol；

C——样品的质量浓度，g/mL。

1.3.7 数据处理 采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析、邓肯氏多重差异显著性分析及皮尔逊分析，结果以均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 低温贮藏过程中水牛肉总蛋白质含量变化

由图1可知，随着贮藏时间的延长，不同贮藏温度下水牛肉中总蛋白质含量不断下降。4 ℃下冷藏第2天，总蛋白含量为23.55 g/100 g，下降幅度仅为2.57%，随后总蛋白质含量几乎呈直线下降；贮藏第6天，总蛋白质含量从最初24.20 g/100 g下降至17.55 g/100 g，下降幅度高达27.48%；贮藏第10天，总蛋白质含量15.49 g/100 g，下降幅度达35.98%。贮藏第10天，-18，-60 ℃下的总蛋白含量分别为18.77，19.93 g/100 g，下降幅度为22.43%，17.63%，显著低于4 ℃的(P<0.05)。前期水牛肉蛋白质含量下降快，主要是由于贮藏前期肉样中蛋白质酶活性较高；但随着贮藏时间的延长，蛋白酶活性不断降低，故贮藏后期水牛肉中蛋白质含量下降变得平缓。Shafi等[15]研究发现-18 ℃冻藏0 d，鲢鱼肉蛋白质含量为20.09 g/100 g，经90 d冷冻贮藏后蛋白质含量降至17.10 g/100 g，下降幅度达14.18%，其下降幅度小于冻藏的水牛肉。随着贮藏时间的延长，低温贮藏过程中水牛肉中蛋白质含量不断降低，可能是由于在肌肉内源酶的作用下，水牛肉蛋白质发生氧化降解，且贮藏温度越高，肌肉中内源酶活性越强，蛋白质降解速度越快，故4 ℃冷藏条件下水牛肉总蛋白质含量下降速度远远快于冻藏条件的。综上，温度对低温贮藏过程中水牛肉总蛋白质含量的变化有显著影响，不同肉类(水牛肉、鱼肉)低温贮藏过程中蛋白质含量下降存在较大差异，可能与动物种类、品种、肌肉部位、肌纤维大小类型及内源酶种类及活性有关。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 低温贮藏过程中水牛肉总蛋白质含量变化

2.2 低温贮藏过程中水牛肉表面疏水性变化

由图2可知，随着贮藏时间的延长，水牛肉的表面疏水性总体呈上升趋势， 其中4 ℃下的表面疏水性从第4天开始几乎呈直线上升，且显著高于-18，-60 ℃的(P<0.05)。4 ℃下冷藏0～4 d，表面疏水性增加缓慢，随后呈直线快速增长；贮藏第10天，表面疏水性达10.74 μg，增加幅度为初始值(0.92 μg)的10.6倍。-18，-60 ℃下贮藏第10天，表面疏水性增加幅度较为缓慢，分别为初始值的1.6，0.3倍，显著低于4 ℃冷藏的(P<0.05)；随后逐渐增大，贮藏第30天，二者的增加幅度分别为初始值(0.92 μg)的5.8，4.8倍，且-18 ℃下的表面疏水性始终高于-60 ℃的。贮藏过程中水牛肉表面疏水性不断增加，主要是由于水牛肉蛋白质分子的构象被羟基自由基氧化而发生改变，导致埋藏在蛋白质内部的疏水性氨基酸暴露[16-17]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 低温贮藏过程中水牛肉表面疏水性的变化

2.3 低温贮藏过程中水牛肉总巯基含量变化

由图3可知，随着贮藏时间的延长，不同贮藏温度下水牛肉总巯基含量总体呈下降趋势。4 ℃下贮藏0～8 d，总巯基含量总体呈直线快速下降，从最初的51.05 nmol/mg蛋白质下降至42.23 nmol/mg蛋白质，下降幅度达17.28%；随后下降速度趋于平缓。-18，-60 ℃下冻藏0～5 d，总巯基含量下降较为平缓，下降幅度分别为2.68%，1.49%；随后两者下降幅度快速增加；贮藏第30天，两者分别为42.08，46.35 nmol/mg蛋白质，下降幅度达17.57%和9.20%，且-60 ℃下的下降幅度始终低于-18 ℃的(P<0.05)。Tao等[18]研究发现滩羊肉中总巯基含量随贮藏时间的增加不断下降，且贮藏温度越高巯基含量越低。贮藏过程中水牛肉中巯基含量不断降低，可能是由于水牛肉中巯基被活性氧(ROS)氧化所致，且巯基含量的降低不仅与参与蛋白质氧化的酶活性有关，还与冰晶对肌原纤维结构的破坏有关[19]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 低温贮藏过程中水牛肉总巯基含量的变化

2.4 低温贮藏过程中水牛肉游离巯基含量变化

由图4可知，随着贮藏时间的延长，水牛肉的游离巯基含量总体呈下降趋势，其中4 ℃下的下降幅度显著高于-18，-60 ℃的。4 ℃下贮藏第2天，游离巯基含量为39.21 nmol/mg蛋白质，下降幅度仅为10.60%，随后呈急速下降趋势；贮藏第10天，游离巯基含量为28.31 nmol/mg蛋白质，下降幅度高达35.45%。贮藏第5天，-18，-60 ℃ 下的游离巯基含量分别为38.32，39.61 nmol/mg蛋白质，下降幅度为12.63%和9.69%；随后下降速度不断加快；贮藏第30天，-18，-60 ℃下的游离巯基含量分别为28.35，29.55 nmol/mg蛋白质，下降幅度高达35.36% 和32.63%，-18 ℃下的下降幅度始终高于-60 ℃ 的。贮藏过程中水牛肉游离巯基含量不断下降，主要是由于活性氧直接攻击水牛肉蛋白质中半胱氨基酸残基上的巯基，并将巯基转变成二硫键及磺酸、亚磺酸、硫代亚磺酸等硫醇氧化产物所致[13]。

2.5 低温贮藏过程中水牛肉羰基含量变化

由图5可知，随着贮藏时间的延长，不同贮藏温度下水牛肉的羰基含量总体呈上升趋势。4 ℃冷藏0～3 d，羰基含量增长相对较为缓慢，贮藏第4天，羰基含量为2.10 nmol/mg蛋白质，增幅达16.02%；随后呈直线快速上升；第10，12天，羰基含量分别为3.26，3.96 nmol/mg蛋白质，增幅分别为初始值的0.81，1.19倍。-18，-60 ℃下贮藏0～5 d，羰基含量分别为2.05，1.91 nmol/mg蛋白质，增加幅度相对缓慢；随后增加幅度逐渐加快；第30天，二者的羰基含量分别为3.76，3.51 nmol/mg蛋白质，增幅分别为初始值的1.08，0.94倍。Rysman 等[13]研究发现随着冷藏时间的不断延长，普通牛肉饼中羰基含量不断增加，冷藏7 d 后，羰基含量增加幅度为初始值的0.65倍。贮藏过程中水牛肉羰基含量不断增加，可能是由于冷藏或冻藏破坏了肌肉的超微结构，并释放自由基，导致蛋白质侧链氨基酸中的氨基和亚氨基氧化形成羰基化合物所致[20]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图4 低温贮藏过程中水牛肉游离巯基含量的变化

字母不同表示差异显著(P<0.05)图5 低温贮藏过程中水牛肉羰基含量的变化

2.6 蛋白质品质指标的相关性

由表1～表3可知，冷藏(4 ℃)和冻藏(-18，-60 ℃)过程中水牛肉总蛋白质含量与表面疏水性、羰基含量呈极显著负相关(P<0.01)。低温贮藏过程中水牛肉总蛋白质含量与总巯基含量、游离巯基含量呈极显著正相关(P<0.01)。表面疏水性与总巯基含量、游离巯基含量呈极显著负相关(P<0.01)，但与羰基含量呈极显著正相关(P<0.01)。低温贮藏过程中总巯基含量与总蛋白含量、游离巯基含量呈极显著正相关(P<0.01)，但与表面疏水性、羰基含量呈极显著负相关(P<0.01)；游离巯基含量与总蛋白、总巯基含量呈极显著正相关(P<0.01)，但与表面疏水性呈极显著负相关(P<0.01)。低温贮藏过程中羰基含量与表面疏水性呈极显著正相关(P<0.01)，但与总蛋白、总巯基和游离巯基含量呈极显著负相关(P<0.01)。综上，冷藏或冻藏条件下，水牛肉蛋白质品质指标之间具有良好的相关性。

表1 4 ℃冷藏过程中水牛肉蛋白质指标间的相关性†Table 1 Correlation analysis between various protein indicators during 4 ℃ refrigerated storage

表2 -18 ℃冻藏过程中水牛肉蛋白质指标间的相关性†Table 2 Correlation analysis between various protein indicators during -18 ℃ frozen storage

表3 -60 ℃冻藏过程中水牛肉蛋白质指标间的相关性†Table 3 Correlation analysis between various protein indicators during -60 ℃ frozen storage

3 结论

试验表明，3种贮藏温度下，随着贮藏时间的不断延长，水牛肉的总蛋白质、总巯基、游离巯基含量总体呈下降趋势，但表面疏水性和羰基含量不断上升。温度对贮藏过程中水牛肉蛋白质的氧化降解有显著影响，降低贮藏温度在一定程度上可以抑制蛋白质的氧化降解并有效延长生鲜水牛肉的货架期。3种贮藏温度下，-60 ℃冻藏的水牛肉蛋白质的氧化降解程度低，肉品质保持效果好。后续可从脂质角度研究贮藏过程中水牛肉品质的变化规律。