DES-UPLC-MS/MS法测定水产品中4种四环素药物残留

刘子雄

谢国丹1

谭贵良2

郑鸿涛1

董 海1

黄景辉3

(1. 中山市食品药品检验所，广东 中山 528437；2. 电子科技大学中山学院，广东 中山 528402；3. 广东利诚检测技术有限公司，广东 中山 528436)

低共熔溶剂(DES)是由一定化学计量比的氢键受体(如季铵盐)和氢键给体(如醇、羧酸、氨基酸和糖等)通过分子间氢键作用组合而成的低共熔混合物[1]。其毒性低、绿色环保、可生物降解，可以作为不同物质的萃取溶剂，且原料价格低廉、制作简便。Zhang等[2-4]将DES应用于食品中合成着色剂及非法添加工业染料的检测，张康迪等[5]将氯化胆碱/乙二醇组成的DES用于食用大豆油中抗氧化剂TBHQ的检测，Zhao等[6]将脯氨酸/丙二醇组成的DES用于食品中农药残留的检测，Shishov等[7]将四丁基溴化铵/丙二酸/乙酸3组分组成的DES用于鸡肉中磺胺类兽药残留的检测；在天然产物分析[8-13]和环境分析[14-17]方面也有相关应用报道。但有关DES在食品中四环素类抗生素检测分析中的应用尚未见报道。

四环素类抗生素是一类由放线菌属产生的或半合成的广谱抑菌剂，包括四环素、土霉素、金霉素和强力霉素等，可作用于多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性敏感菌，临床上用于立克次体、衣原体和支原体等所致感染。水产养殖中，因四环素类药物对水产动物的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌等病原菌有效，故被广泛用于预防和治疗水产动物疾病[18]。当前，食品中四环素类抗生素定量检测的主流方法为高效液相色谱法和液相色谱—串联质谱法，其前处理过程分为两种：① 使用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液或酸化乙腈提取，再经固相萃取(SPE)小柱净化，浓缩复溶后上机检测[19-21]；② 用酸化乙腈—水体系提取目标物，然后经QuEChERS方法净化后上机检测[22-23]。两种方法均会使用较多的有毒有机试剂，对环境不友好，且用SPE小柱净化操作繁琐，耗时较长。试验拟使用DES这种新型、绿色萃取技术，结合超高效液相色谱—串联质谱(UPLC-MS/MS)法建立水产品中四环素类药物残留的检测分析方法，为实现市售水产品的快速定性和定量检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

虾、草鱼、白鳝、多宝鱼及三文鱼等13 批水产品：市售；

虾肉中四环素定量分析质控样品：中国检验检疫科学研究院测试评价中心；

虾肉中四环素测定能力验证测试样品：英国Fapas分析实验室；

甲醇：色谱纯，德国Merck公司；

甲酸：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；

氯化胆碱、乙二醇、丙三醇、丁二醇：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

标准物质盐酸四环素(97.15%)、盐酸土霉素(96.02%)、盐酸金霉素(92.9%)及盐酸强力霉素(99.3%)：德国Dr Ehrenstorfer公司。

1.1.2 主要仪器设备

超高效液相色谱—三重四级杆串联质谱仪： 1290/6460C型，带Jet Stream电喷雾离子源(JetESI)，美国Agilent公司；

纯水系统：Milli-Q Integral 3 System型，美国Millipore公司；

冷冻离心机：3-18 K型，德国Sigma公司；

分散机：T25 easy clean digital型，德国IKA公司；

超声波清洗仪：SCQ-7201E型，上海声彦超声波仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DES的制备 选用氯化胆碱作为氢键受体，乙二醇、丙三醇和1,4-丁二醇作为氢键给体，按不同化学计量比称量至250 mL鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪中，常压下、70 ℃水浴搅拌，直至形成透明均一的液体，最终得到11 种不同类型的DES，详见表1。

表1 不同类型的低共熔溶剂Table 1 Different types of DES

1.2.2 标准储备液及工作液的配制 准确称取按其纯度折算为100%质量的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素各10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至10.00 mL，得质量浓度为1 mg/mL的储备液。再分别取适量四环素、土霉素、金霉素和强力霉素储备液，用甲醇定容至10.00 mL，得质量浓度为1 μg/mL的混标中间工作液。绘制标准工作曲线时，根据样品情况用阴性基质提取液稀释中间工作液至不同浓度，现配现用。

1.2.3 仪器分析条件

(1) 色谱条件：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)；流速0.4 mL/min；柱温30 ℃；进样体积5 μL；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序：0.0 min，95% A；2.5 min，85% A；6.9～7.0 min，80% A；9.0～12.5 min，40% A；13.0 min，95% A。

(2) 质谱条件：带Jet Stream电喷雾离子源(JetESI)；多反应监测(MRM)；ESI+模式扫描；鞘气流量11 L/min；鞘气温度350 ℃；雾化气压力0.31 MPa；喷嘴电压500 V(ESI+)/1 000 V(ESI-)；毛细管电压4 000 V(ESI+)/3 500 V(ESI-)；驻留时间20 ms，其他条件见表 2，质谱图见图 1。

图1 四环素类药物质谱图Figure 1 Mass spectrum of tetracyclines

表 2 四环素类药物的质谱信息†Table 2 Mass parameters of tetracyclines

1.2.4 样品前处理方法 称取1.00 g样品至15 mL带刻度塑料离心管中，加入DES提取液3.0 mL，冰水浴10 min，均质1 min，冰水浴超声10 min，5 ℃、10 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至带刻度15 mL离心管中；残渣中加入3.0 mL DES提取液，重复提取1次，合并上清液，用初始流动相定容至7.0 mL。过0.22 μm 聚四氟乙烯(PTFE)针式滤膜，上机检测。

1.2.5 DES条件优化

(1) DES种类选择：在1 g阴性虾肉样品中添加200 μL 的混标中间工作液(1 μg/mL)，分别用制备好的DES进行提取，按1.2.4的方法进行检测，考察DES种类对分析药物提取效率的影响。

(2) DES含水量：在最优DES中加入不同比例的水作为提取溶剂，按1.2.4的方法对1 g阴性加标样品(添加量200 ng)进行检测，考察低共熔溶剂含水量(80%，85%，90%，95%)对分析药物提取效率的影响。

(3) DES溶剂pH：以虾肉中四环素测定质控样为样品，以最优含水量下的最优DES为提取溶剂1(pH 8.56)，在溶剂1中分别添加至含0.1%，0.5%，1.0%的甲酸后作为提取溶剂2(pH 2.60)、溶剂3(pH 2.25)和溶剂4(pH 2.07)，按1.2.4的方法进行检测；将GB/T 21317—2007 中Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH 4.0)作为提取溶剂5，考察低共熔溶剂pH对分析药物提取效率的影响。

1.2.6 线性和检出限的测定 取四环素类药物混合标准使用液，用阴性基质提取液稀释配置成 5.0，10.0，20.0，100.0，200.0 ng/mL的混合标准工作液，按1.2.3的方法进样测定，以质量浓度为横坐标，各分析物定量离子的离子丰度为纵坐标，绘制标准工作曲线，考察标准工作曲线的线性范围和相关系数。试验条件下，取阴性样品1 g，加入不同浓度的混标溶液，按1.2.4 的方法进行前处理，上机检测，依照信噪比为3(S/N=3)计算检出限(LOD)。

1.2.7 方法精密度和准确度的测定 方法精密度以相对标准偏差(RSD)表示，按1.2.4的方法处理检测，计算6次平行测定结果的RSD，以验证方法的精密度。准确度以样品加标回收率表示，对试样进行3个浓度水平加标，每个水平重复3 次，以验证方法的准确度。

1.2.8 数据处理 使用安捷伦 Date Acquisition、Qualitative Analysis和 Quantitative Analysis工作软件对研究的 4 种四环素类分析药物的定量定性离子进行数据处理，保留时间和定性离子进行定性，峰面积外标法定量；用 Excel 软件对DES条件优化数据、精密度、回收率及样品含量数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法优化

2.1.1 DES种类的选择 DES制备过程中发现，制备好的DES-10和DES-11冷却至室温(25 ℃)后会有结晶析出，是因为随着温度的降低，DES组分之间的氢键被破坏，因此其不适用于室温以下对目标物的萃取，而另外9种 DES在室温条件下呈液态，可用于后续研究。由图2可知，DES-3和DES-6对4种四环素类药物有较优的提取效率，但对于金霉素，DES-6比DES-3有更优的提取效率，所以选择DES-6(氯化胆碱/丙三醇，摩尔比1∶4)作为试验方法的最佳提取溶剂。

图2 溶剂对分析药物提取效率的影响Figure 2 Effect of solvent types on extraction efficiencyof four analytes

2.1.2 DES含水量的选择 亲水性低共熔溶剂的黏度较大，不适合直接提取，且含水量是影响目标组分提取效果的重要因素，加入适量的水可有效降低DES的黏度及调节其极性[11-12]。由图3可知，当低共熔溶剂含水量由80%上升至95%时，四环素类药物提取率均发生显著变化，四环素呈增加趋势，土霉素、金霉素和强力霉素呈先增加后降低的趋势，当含水量为90%时达最大值，综合考虑选择含水量为90%的DES-6进行后续研究。

图3 低共熔溶剂含水量对分析药物提取效率的影响Figure 3 Extraction efficiency of analytes using DESwith different moisture content

2.1.3 DES溶剂pH的选择 四环素类药物在碱性条件下易生成异构体，在较强酸性环境中(pH<2)易发生消去反应生成脱水物，发生降解[20-21]。由表3可知，溶剂1处理结果远低于质控样的特性值，是因为溶剂1的pH处于弱碱性，四环素容易生成异构体，从而影响结果；溶剂2、溶剂3、溶剂4、溶剂5处理结果均在特性值区间范围内，符合要求，且运用DES前处理和运用GB/T 21317—2007前处理结果无显著差异，因此选择溶剂2(pH 2.60)作为试验方法的最终提取溶剂。

表3 pH对四环素提取效率的影响Table 3 Effect of pH on extraction efficiency of tetracycline μg/kg

2.2 方法的线性和检出限

由表4可知，各分析药物均呈良好线性关系，r≥0.999 4。分析药物的LOD为20.0 μg/kg，而GB/T 21317—2007中四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的LOD均为50 μg/kg。综上，试验方法具有较高的灵敏度。

表4 分析药物的线性范围和检出限Table 4 Linear equations and limits of detection(LOD) of the analytes

2.3 方法的精密度和准确度

由表5可知，RSD(n=6)为3.4%～5.2%，<10%；4种四环素类药物在3个加标水平下的加标回收率为82.2%～102.8%，符合日常分析检测的要求。

表5 回收率和精密度Table 5 Recovery and precision (n=6)

2.4 样品检测

运用试验方法对市售的13批水产品(虾6批，三文鱼2批，草鱼3批，白鳝及多宝鱼各1批)、1批质控样及1批国际能力验证测试样品进行检测分析，结果表明，市售水产品中有1批次虾肉分别检出土霉素(64.8 μg/kg)和强力霉素(25.4 μg/kg)，而质控样品和国际能力验证样品的检出值均在给定已知的特性区间范围内，说明试验建立的方法检测结果准确。

3 结论

建立了低共熔溶剂萃取—超高效液相色谱—串联质谱法(DES-UPLC-MS/MS)快速检测水产品中的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的分析方法。结果表明，与传统的SPE固相萃取净化技术相比，试验方法前处理具有有机试剂用量少、毒害小、操作步骤简便及处理时间短等特点，且分析系统具有良好的线性关系和更低的检出限，可用于水产品中四环素类药物残留的快速定性和定量检测。在DES条件优化中，低共熔溶剂氢键受体和氢键给体选择方面还是比较单一，后续可尝试更多的组合来制备DES，从而寻求更优的试验方案。