O2/CO2主动自发气调对采后松露贮藏品质及微观结构的影响

蒋方国

胡海洋1

龚晓源1

刘 杰2

李 翔1

(1. 成都大学食品与生物工程学院, 四川 成都 610106；2. 重庆建设汽车系统股份有限公司，重庆 400054)

松露是块菌属真菌的子囊果，在土壤或落叶层中与植物根系共生，富含蛋白质、维生素、脂肪酸等营养物质[1]，并含有具有缓解疲劳、抑制癌细胞、调节女性生理周期等功能的多糖、α-雄烷醇及甾醇类等多种生理活性物质[2-4]。由于其独特且浓郁的香气备受消费者青睐，欧洲人将其盛赞为“王公贵族之珍馐”[5]。然而，短暂的采收期和保质期限制了其市场的向外扩张[6]。松露采后会因机械损伤、环境胁迫、微生物浸染导致的呼吸作用加剧而极易腐败变质，其腐败产生的乳酸和乙醇虽然可以保护松露免受表面霉菌和细菌的侵害，但有香气变化的潜在风险[7]。目前国内外多采用气调、辐照、保鲜剂等技术对果蔬进行保鲜[8]，但一些化学保鲜剂具有环境污染和毒副性[9]；辐照虽能杀灭病原微生物，抑制果蔬的某些代谢活动，保留原有营养和风味物质，但存在效果不显著甚至加快果实衰老以及使用剂量的安全性问题[10-12]。

主动自发气调(AMAP)是指通过控制密闭环境中的气体成分，利用果蔬自身呼吸从而达到有利于保鲜目的的气体环境的方法[13]。王亮等[14]发现50% O2+50% CO2AMAP可有效调节西兰花体内pH值和呼吸关键酶活性，形成稳定的能量代谢，从而维持西兰花贮藏品质。黄雪等[15]采用O2/CO2AMAP处理羊肚菌，贮藏第8天，100% O2处理易造成内部白斑，而过高的CO2处理则易出现白化和异味现象。Liu等[16]研究表明80% O2能防止香菇褐变，延缓膜透性和脂质过氧化的增加，并能增强抗氧化和氧自由基清除酶的活性。Fagundes等[17]表明樱桃番茄在AMAP协同5 ℃条件贮藏，由于CO2和O2的作用，降低了呼吸速率和乙烯的产生，维持组织硬度，并抑制了如糖类、有机酸、番茄红素等物质的化学反应，使樱桃番茄的衰老得到了有效控制。目前，有关松露在O2/CO2AMAP中保鲜性能的研究还未见报道。试验拟探究松露在不同初始比例的O2/CO2气体密闭环境中的贮藏品质和微观结构，以期得到一种新型而有效的松露鲜贮方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

松露子实体：采摘于攀枝花市，采后立即置于冰袋低温盒中运回成都大学实验室，短时内用湿润软毛刷去污、清水冲洗后摘除成熟度低、质地软化、寄生或者损伤严重的个体，于层流空气中干燥，4 ℃预冷12 h后选择质量与成熟度相近的松露进行试验，四川品高农产有限公司；

三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、2,6-二氯靛酚、福林酚、戊二醛、醋酸异戊酯、邻苯二酚：分析纯，成都科隆化学品有限公司；

食品级PP保鲜盒：220 mm×130 mm×40 mm，重20 g，诸城市万瑞塑胶有限公司；

密闭不透气双层PE薄膜：单层厚0.02 mm，深圳市汇丰包装科技有限公司；

吸潮纸：昆明大道生包装材料有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外分光光度计：UV-8000型，上海精密仪器仪表有限公司；

台式高速冷冻离心机：BY-R20型，北京白洋医疗器械有限公司；

气调包装机：MAP-JY260型，上海积亿机械有限公司；

电导率仪：DDS-307A型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

扫描电子显微镜：Phenom XL G2型，复纳科学仪器(上海)有限公司；

硬度计：GY-3型，上海玖荣实业有限公司；

手持糖度计：WYT-32型，上海易测仪器设备有限公司。

1.2 试验设计

将预冷完成的松露随机分为4个气调组和1个自然空气(CK)组，每组5个气调保鲜盒，各放入(300±5.00) g样品，装载量为1/4，保鲜盒底部垫一层吸潮纸，利用气调包装机按表1将气体分别充入各保鲜盒，用双层PE薄膜封口，CK陈放于空气中，不封口。抽气时间4.00 s；充气时间4.00 s；热封时间2.00 s；热封温度152 ℃。于4 ℃、相对湿度为90%～95%冷库中贮藏，每7 d取样1次，各相关指标重复测定3次取平均值。

表1 气体组分比例Table 1 Radio of gas content %

1.3 相关指标测定

1.3.1 失重率 按式(1)计算松露的失重率[18]。

(1)

式中：

W——失重率，%；

M1——松露贮藏前质量，g；

M2——松露贮藏后质量，g。

1.3.2 可溶性固形物含量 取10 g松露于研钵，待充分研磨后用4层纱布过滤，使用手持糖度计测定可溶性固形物的百分比含量。

1.3.3 腐烂率 将软化、霉变、发黏及异味等现象作为松露腐烂的指示标准，按式(2)计算腐烂率。

(2)

式中：

D——腐烂率，%；

X1——腐烂个数；

X2——处理总数。

1.3.4 维生素C含量 按GB 5009.86—2016执行。

1.3.5 呼吸速率 参照Ye等[19]的方法。

1.3.6 丙二醛(MDA)含量 参照Yang等[20]的方法。

1.3.7 纤维素(Cx)酶活性

(1) 酶液制取：精确称取5.000 g松露，剪碎后置于预冷的研钵中，加入适量磷酸缓冲液研磨均匀后定容，4 000 r/min 离心20 min，上清液于4 ℃保存备用。

(2) Cx酶活性：参照刘德海等[21]的方法并稍改动，将酶液稀释10倍待用，取6只10 mL带塞试管，5只样品管中加入2 mL CMC溶液，50 ℃预热3 min，加入0.5 mL稀释酶液，50 ℃保温30 min。待保温快结束时取空白管先后加入2 mL CMC溶液和2.5 mL DNS溶液。保温结束后向各样品管中加入2.5 mL DNS溶液并向空白管中加入0.5 mL酶液，沸水浴8 min，冷却后空白调零测OD530 nm值。

1.3.8 多酚氧化酶(PPO)活性 参照张菊华等[22]的方法。

1.3.9 扫描电镜 松露去皮后切成4 mm×4 mm×3 mm 小片，4 ℃下、5%戊二醛固定2 h，用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗浸泡10 min，重复操作3次，分别用30%，50%，70%乙醇脱水20 min，用80%，90%，100%乙醇脱水10 min。醋酸异戊酯代替100%乙醇溶液脱水10 min，将试样取出进行CO2临界点干燥以及离子溅射喷金处理，于扫描电子显微镜下观察。

1.3.10 数据处理 所有试验数据经SPSS软件进行显著性差异分析(P<0.05为差异显著)，采用Excel 2016软件绘图。

2 结果与分析

2.1 对失重率及可溶性固形物含量的影响

由图1(a)可知，贮藏期间，各处理组的失重率均呈上升趋势，但AMAP4处理的失重最为严重，贮藏7 d后失重率高于CK处理，可能是随着呼吸作用的进行，蒸腾失水的同时，气调包装中氧气被快速利用，CO2含量过高致使产生无氧呼吸而造成有机物被过多消耗而导致失重率急剧上升。而其他处理的失重率在整个贮藏期间明显(P<0.05)低于CK和AMAP4处理，且AMAP1与AMAP2处理相差不明显，而AMAP3处理在贮藏后期才显示出一定优势，更适合长期保鲜。

图1 O2/CO2 AMAP对松露失重率及可溶性固形物含量的影响Figure 1 Effect of O2/CO2 AMAP on weight loss rate and soluble solid content of truffles

由图1(b)可知，各处理组的可溶性固形物含量均呈先增后减的趋势，其上升可能是贮藏期间松露的失水和子实体内蛋白质等大分子向可溶性小分子的转化而导致的，而下降是因为呼吸作用[23]。贮藏期间，4个气调组的可溶性固形物含量均显著高于CK处理(P<0.05)，CK与AMAP4处理的在第7天达到峰值，后又呈快速下降的趋势。其余3个处理在第14天达到峰值，可能与不同气调处理影响各种物质的活化速度有关，可以延长松露后熟时间，与员丽苹等[24]的结果类似。AMAP3处理的可溶性固形物含量下降平缓且在第28天回落到初始水平，均高于其他4个处理组，说明AMAP3处理有助于降低松露对呼吸底物的消耗速率，从而减缓松露的衰老，保证其食用品质。

2.2 对腐烂率的影响

由图2可知，随着贮藏时间的增加，各处理组的腐烂率均呈上升趋势，松露从土壤中挖掘出后就一直暴露在空气中，失水和病原菌使其变得高度易腐[7]。CK处理在贮藏7 d内逐渐出现腐败，而其他处理组在贮藏7 d后才发生腐烂且程度明显低于CK处理，表明O2/CO2主动自发气调在降低腐烂率上具有良好的效果。AMAP3处理的腐烂率最低，保鲜效果最好，表明一些病原微生物可能对AMAP3处理的气体成分敏感。Hoogerwerf等[25]证实80% O2+20% CO2气调处理可明显抑制灰葡萄孢菌的生长。张玉笑等[26]研究表明O2/CO2主动自发气调可更好地控制果蔬贮藏过程中枝孢菌的危害。

图2 O2/CO2 AMAP对松露腐烂率的影响Figure 2 Effect of O2/CO2 AMAP on decayrate of truffles

2.3 对松露维生素C含量的影响

由图3可知，贮藏期间，各处理组维生素C含量均呈下降趋势，贮藏第7天，AMAP4处理的维生素C含量低于CK处理，且28 d内的含量均显著低于其他3个气调组，说明高含量的O2有利于减缓松露维生素C的下降速度且效果明显，对维持松露的营养价值具有重要作用，而10% O2气调处理不仅难以保留松露维生素C含量甚至会加剧其损失，与车东等[27]、杨震峰等[28]的结论类似。

图3 O2/CO2 AMAP对松露维生素C含量的影响Figure 3 Effect of O2/CO2 AMAP on VC contentof truffles

2.4 对松露呼吸速率的影响

由图4可知，松露是一种呼吸跃变型果实，贮藏期间，除CK和AMAP3处理外，其余气调组的呼吸速率大体呈“M”型波动。CK处理的呼吸高峰出现在贮藏第7天，而贮藏中、后期急剧下降，可能是因为腐烂程度过高使松露的呼吸系统受到严重破坏。AMAP1、AMAP2和AMAP4处理具有双呼吸高峰，分别出现在贮藏第7，21天，而AMAP3处理的呼吸高峰只在贮藏第21天出现，且呼吸速率最低。CK处理的平均呼吸速率为205.60 mg/(kg·h)，其他处理的分别为223.58，250.73，187.81，196.69 mg/(kg·h)，AMAP3和AMAP4处理的呼吸作用受到明显抑制，而AMAP3呼吸波动最弱，表现最好，说明合适的初始气体比例形成适宜松露贮藏的微环境，推迟了呼吸高峰并降低了呼吸速率，维持了营养品质。

图4 O2/CO2 AMAP对松露呼吸速率的影响Figure 4 Effect of O2/CO2 AMAP on respiratoryrate of truffles

2.5 对松露MDA含量的影响

由图5可知，除CK处理的MDA含量增加外，其余组均呈先增后降再增的趋势，贮藏前期，MDA含量的升高可能是气体胁迫导致松露组织产生大量的自由基，积累到一定程度后引起细胞膜脂过氧化，使膜的结构和功能受到严重损害，同时生成MDA加重对蛋白质、核酸及膜等大分子生物成分的攻击，进一步损伤细胞膜，增加其透过性[29]。随后，松露的防御机制启动，MDA被分解致使含量下降，但随着自我修复功能的削弱，MDA又开始合成，含量逐步上升。贮藏第28天，AMAP2和AMAP3处理的MDA含量接近但与AMAP1、AMAP4处理的差异显著。AMAP4处理的MDA含量最高为11.68 nmol/g，而AMAP3处理的最低为5.26 nmol/g，同时在整个贮藏期间都维持在较低水平，说明其气体比例有效地降低了MDA的积累，与黄雪等[15]的结论一致。

图5 O2/CO2 AMAP对松露MDA含量的影响Figure 5 Effect of O2/CO2 AMAP on MDAcontent of truffles

2.6 对松露Cx酶活性的影响

由图6可知，贮藏期间，各处理组的Cx酶活性均不断上升，4个气调组的Cx酶活性显著低于CK组(P<0.05)，且初始氧气含量在40%及以上气调处理的Cx酶活性整体上低于10% O2的，说明较高含量的O2可以更好地抑制松露的软化。贮藏第28天，AMAP3处理的Cx酶活性最低，分别比AMAP1、AMAP2、AMAP4处理低11.39，15.15，19.50 U/g。因此，AMAP3处理相比较于CK和其他处理，更有效地降低了Cx酶活性，从而维持了松露的硬度。有研究[30]表明，双孢蘑菇在贮藏后期由于纤维素酶活性升高加快纤维素分解，可能出现菌体自溶现象，而维持较低的纤维素酶活力可以保持良好的质地。

图6 O2/CO2 AMAP对松露Cx酶活性的影响Figure 6 Effect of O2/CO2 AMAP on Cxenzymeactivity of truffles

2.7 对松露PPO活性的影响

由图7可知，贮藏第7天，4个气调组气体控制条件下松露的PPO活性均显著高于CK处理的。当松露所处的环境发生改变后，PPO作为松露体内一种应激性酶对其作出响应，使得PPO活性被激活并在短时间内提高从而开启松露抵御外界伤害的自我保护机制。一旦松露适应了这种胁迫，PPO活性将回到原状态，故贮藏第14天的PPO活性出现了回降现象，之后，各处理组PPO活性又不断上升，AMAP1、AMAP2及CK 3组上升迅速，其余2组上升缓慢，且AMAP3处理表现最佳，说明AMAP3处理在贮藏中、后期有效抑制了PPO活性，防止果实发生褐变。这可能是因为贮藏后期，呼吸产生的高浓度CO2形成了高压CO2环境，而高压CO2可能以改变PPO的三级结构或干扰PPO的疏水活性位点的方式使其失活，从而减弱了PPO活性上升的趋势[31]。

2.8 对松露微观结构的影响

由图8可知，新鲜松露子囊果的子囊孢子壁外表光滑饱满，相互之间呈致密分布，无凹陷和空洞。贮藏第14天，只有AMAP3处理的子囊孢子壁仍能保持完整饱满且致密的结构，分布也较为均匀，子囊之间空隙小，说明其有效保留了水分，细胞壁受损程度低，有利于维持松露正常的生理活动；CK和AMAP4处理因失水过度导致子囊严重干瘪，而AMAP1和AMAP2处理的子囊之间黏连在一块，各子囊的形状无法清晰分辨出。贮藏第28天，各处理组的子囊均出现一定程度的剥离和皱缩，形成空洞，但CK处理的剥离最为严重，子囊相互之间间隙最大，而AMAP3处理也有空洞和皱缩出现，但程度相对最浅，说明适宜气调处理的松露可有效减少质量损失，通过维持细胞的正常形态进而减弱MDA、PPO以及Cx酶等对组织的损伤，与朱继英等[32]、Wu等[33]的结论类似。

图8 O2/CO2 AMAP对松露微观结构的影响Figure 8 Effect of O2/CO2 AMAP on microstructureof truffles

3 结论

试验表明，松露具有呼吸跃变特性，40% O2+60% CO2处理可将呼吸高峰推迟至第21天，有效减缓营养物质的损失，并将松露货架期延长至4周。40% O2+60% CO2处理能够保持松露子囊较为饱满的状态，降低纤维素酶和丙二醛对细胞壁膜的破坏，维持正常的生理活动，有利于松露保鲜。这是由于40% O2+60% CO2处理的气体比例结合低温形成的微环境可使松露的新陈代谢快速到达平衡，保持低能耗状态，高含量的O2可直接抑制厌氧菌的生长繁殖并且缓解CO2的侵害，减少腐烂。后续可进一步优化不同初始气体比例的保鲜性能，并深入研究O2/CO2主动自发气调保鲜松露的具体机制。