法夫酵母类胡萝卜素对UVA氧化损伤HSF细胞的保护作用

陈晓晨，白曼利，陈昭华*，杜希萍，2，3，4

（1. 集美大学海洋食品与生物工程学院，厦门 361021；2. 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，厦门361021；3. 厦门市食品与生物工程技术研究中心，厦门 361021；4. 厦门南方海洋研究中心海藻资源化利用与深加工重点实验室，厦门 361021）

由于环境污染造成臭氧层破坏，地表紫外线强度大大增加，强烈的紫外辐射给人类造成了炎症、光氧化损伤、癌症等多种损伤［1］，起到主要作用的是长波长紫外线（Ultraviolet A，UVA）和中波长紫外线（Ultraviolet B，UVB）辐射。其中，UVA具有很强的穿透力，能够达到皮肤真皮层，对真皮层的成纤维细胞造成氧化损伤［2］。有研究表明，具有共轭双键结构的有机分子可以吸收短波紫外线，较长波长的紫外线则被具有线性重复结构或环状结构的有机分子吸收［3］。

类胡萝卜素是由植物和微生物合成的最常见的天然色素之一，也是重要的抗氧化剂，可以通过抵消自由基的作用来减少炎症和防止氧化损伤［4］，具有抗炎［5］、抗粥样动脉硬化［6］、抗糖尿病［7］、预防心血管疾病［8］等生物活性，被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。如图1～3所示，虾青素（astaxanthin）、β-胡萝卜素（β-carotene）和海胆酮（echinenoneon）均是酮式类胡萝卜素，具有共轭双键结构。其中，虾青素与β-胡萝卜素属于胡萝卜素类，天然存在于许多甲壳类动物、藻类和微生物中［9］，海胆酮则属于叶黄素类，主要存在于海胆中［10］。虾青素骨架中共轭双键及α-羟基酮的存在使其具有更强的抗氧化性以及其他重要的生物活性［11］，被称为“超级抗氧化剂”。

图1 虾青素的分子结构式Fig. 1 The molecular structure of astaxanthin

在我们实验室之前的研究中，以法夫酵母（Phaffia rhodozyma）为原材料制备出虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮［12］，但它们对紫外辐射导致的皮肤损伤是否具有保护作用还未知。本文拟通过单一类胡萝卜素虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮及三者按一定质量浓度组合作用于UVA氧化损伤的人皮肤成纤维（human skin fibroblasts，HSF）细胞，研究HSF细胞的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的变化，阐明类胡萝卜素对UVA氧化损伤的保护作用，为应用类胡萝卜素开发对UVA辐射氧化损伤具有保护作用的化妆品和保健品提供理论依据和支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

P. rhodozyma菌体由厦门汇盛生物有限公司提供；虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮由本实验室从P.rhodozyma菌体中制备［12］；甲基噻唑蓝［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT］购于美国Sigma公司；高糖培养（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）基购于美国HyClone公司；胎牛血清购于以色列Biological Industries；100×抗生素（10 000 IU/mL氨苄青霉素和10 mg/mL硫酸链霉素）溶液购于Sigma-Aldrich中国上海公司；LDH活性检测试剂盒、MDA含量检测试剂盒购于北京索莱宝（Solarbio）科学技术有限公司。

图2 β-胡萝卜素的分子结构式Fig. 2 The molecular structure of β-carotene

图3 海胆酮的分子结构式Fig. 3 The molecular structure of echinenone

1.2 主要仪器与设备

UVA灯管（320～420 nm），Philips；台湾先驰紫外线辐照计ST513，Krevor；AL104分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HERACELL Vois 160i型CO2培养箱，德国赛默飞世尔科技公司；TS-100倒置显微镜，日本尼康（Nikon）公司；BioTek Cytation-5酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HSF细胞的培养与传代

将HSF细胞接种于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞达到80%～90%融合时，吸弃培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液洗2次，之后用0.25%胰酶消化2～3 min，吸弃消化液，加入DMEM培养基，制成细胞悬液，按1∶4传代至培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3.2 UVA辐照剂量对细胞的影响

6根平行的8 W紫外灯管为UVA光源，灯管距试验台7.5 cm，预热10 min，将紫外辐照强度稳定在13.5 mW/cm2，通过改变辐照时间改变UVA的辐照剂量。即UVA辐照剂量（J/cm2）= UVA辐照强度（W/cm2）× 辐照时间（s）［13］。

设置辐照时间分别为0、10、16、20、24、28 min，即辐照剂量分别为8.10、12.96、16.20、19.44、22.68 J/cm2。吸弃待辐照细胞的原培养基，用PBS缓冲液清洗细胞，加少量PBS覆盖细胞后进行辐照试验。辐照结束后，吸弃PBS，加入DMEM培养基，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，基于MTT法［14］测定细胞存活率，确定细胞半致死辐照剂量，每组设置4个平行试验。

1.3.3 细胞形态分析

将HSF细胞以1.5×105个/mL接种于6孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞融合为80%～90%时用不同辐照剂量的UVA辐照细胞。辐照结束后，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，用倒置显微镜（200×）观察细胞形态。

1.3.4 单一类胡萝卜素对HSF细胞的影响

将HSF细胞以1.5×105个/mL接种于96孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中孵育，当细胞融合为80%～90%时，加入不同质量浓度（0、0.5、5.0、10.0、15.0、20.0 µg/mL）的样品，继续孵育2 h后，吸弃溶液，加入DMEM培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。应用MTT法测定细胞存活率。根据细胞存活率，选择单一类胡萝卜素的低质量浓度、中质量浓度和高质量浓度，进一步将低质量浓度、中质量浓度和高质量浓度进行不同组合，用于后续研究类胡萝卜素对UVA诱导HSF细胞氧化损伤的保护作用。

1.3.5 不同胡萝卜素组合对UVA诱导HSF细胞氧化损伤的保护作用

将HSF细胞以1.5×105个/mL接种于96孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中孵育，当细胞融合为80%～90%时，加入不同质量浓度组合的类胡萝卜素样品，继续孵育2 h后，吸弃溶液，用PBS缓冲液洗2次，之后96孔板底部用少量PBS缓冲液覆盖，用1.3.2中得到的细胞半致死辐照剂量辐照细胞，辐照结束后弃PBS，加入DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。应用MTT法测定细胞存活率。空白组不加样品、无UVA辐照，对照组不加样品、进行UVA辐照，试验组为加样品、进行UVA辐照，每组设置6个平行试验。

1.3.6 类胡萝卜素对UVA辐照HSF细胞中LDH活性和MDA含量的影响

将HSF细胞以3.0×105个/mL接种于6孔板中，2 mL/孔，当细胞融合为80%～90%时，加入样品溶液，孵育2 h，吸弃溶液，用PBS缓冲液洗2次，之后加少量PBS覆盖6孔板底部，用1.3.2中得到的细胞半致死辐照剂量辐照细胞，辐照结束后，吸弃PBS，加入DMEM培养基，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。根据LDH活性检测试剂盒和MDA含量检测试剂盒的步骤分别测定LDH活性和MDA含量。空白组不加样品、无UVA辐照，对照组不加样品、进行UVA辐照，试验组加样品、进行UVA辐照，每组设置3个平行试验。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0进行数据统计分析，采用Microsoft Excel 2013进行绘图，用平均值±标准差表示试验数值。

2 结果与分析

2.1 UVA辐照剂量对HSF细胞存活率的影响

如图4所示，在辐照剂量范围内，随着UVA辐照剂量的增加，细胞存活率降低，表明辐照对HSF细胞的增殖具有抑制作用，并且呈剂量依赖性。当辐照剂量分别为12.96 J/cm2和16.20 J/cm2时，细胞存活率分别为56.05%和51.23%，两者没有显著性差异（P＞0.05），因辐照剂量为16.20 J/cm2时细胞存活率更接近半致死率，故选择16.20 J/cm2为后续试验的辐照剂量。

图4 UVA辐照剂量对HSF细胞存活率的影响Fig. 4 The effect of UVA irradiation dose on HSF cell survival rate

2.2 UVA辐照剂量对HSF细胞形态的影响

如图5a所示，正常的HSF细胞多为长梭状，细胞密集。当UVA辐照剂量为8.10 J/cm2，如图5b所示，细胞开始皱缩变圆且密度减少，出现脱颗粒现象。当辐照剂量进一步增加到16.20 J/cm2（图5c）和24.30 J/cm2（图5d）时，细胞密度进一步减少，且与正常细胞相比，细胞间隙增大更明显。此观察结果与张永祥等［15］研究中经UVA辐照后的HSF细胞的形态一致，与MTT法测定HSF细胞活力的结果相对应，即随着辐照剂量的增加，细胞的存活率逐渐减小。

图5 UVA辐照剂量对HSF细胞形态的影响（200×）Fig. 5 The effects of UVA irradiation dose on morphology of HSF cell（200×）

2.3 单一类胡萝卜素对HSF细胞的影响

图6～8分别表示不同质量浓度的虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮对HSF细胞存活率的影响。可以看出，虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮单一地作用于HSF细胞时，细胞存活率的整体趋势表现为先增加后减少。图6中，当虾青素的质量浓度为15.0 µg/mL时，HSF细胞的存活率达到最大且与对照组存在显著性差异（P＜0.05），因此选15.0 µg/mL作为中质量浓度；虾青素质量浓度为5.0 µg/mL时的细胞存活率较高，且与15.0 µg/mL的存活率有显著性差异（P＜0.05），故选此质量浓度作为低质量浓度；此外虾青素为20.0 µg/mL时的细胞存活率较高，因此选择20.0 µg/mL为高质量浓度，从而得到虾青素的低、中、高质量浓度。图7和图8中，选择细胞存活率最大的质量浓度为中质量浓度，在其质量浓度前后分别选择细胞存活率较大的浓度为低质量浓度和高质量浓度，从而得到β-胡萝卜素的低质量浓度、中质量浓度和高质量浓度分别为0.5、5.0和10.0 µg/mL；海胆酮的低质量浓度、中质量浓度和高质量浓度分别是0.5、10.0和15.0 µg/mL。

图6 虾青素对HSF细胞存活率的影响Fig. 6 The effects of astaxanthin concentration on HSF cell survival rate

图7 β-胡萝卜素对HSF细胞存活率的影响Fig. 7 The effects of β-carotene concentration on HSF cell survival rate

图8 海胆酮对HSF细胞存活率的影响Fig. 8 The effects of echinenone concentration on HSF cell survival rate

2.4 不同类胡萝卜素组合对UVA诱导HSF细胞氧化损伤的保护作用

将2.3中所得的虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮三种类胡萝卜素的低质量浓度、中质量浓度和高质量浓度进行排列组合，作用于UVA辐照后的HSF细胞，研究不同类胡萝卜素组合对UVA诱导HSF细胞氧化损伤的保护作用。结果如表1所示。

由表1可以看出，经UVA辐照后对照组HSF细胞的存活率降低至（49.30±1.48）%，接近细胞半致死率，与空白组相比显著下降（P＜0.05），表明UVA辐照对HSF细胞有较严重的氧化损伤作用。不同类胡萝卜素组合作用于UVA损伤的HSF细胞后，其细胞存活率不同。当组合中的虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮分别为20.0 µg/mL、0.5 µg/mL和0.5 µg/mL时，HSF细胞存活率达到最大为（59.07±3.04）%，显著大于对照组（P＜0.05），表明该组合对辐照损伤的细胞具有最强的保护作用，故选择此样品质量浓度组合用于后续研究。当虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮分别为20.0 µg/mL、5.0 µg/mL和10.0 µg/mL时，细胞存活率最小，为（40.00±2.00）%，显著小于对照组（P＜0.05）。除该组合外，还有4组排列组合的细胞存活率低于对照组，表明对辐照损伤后的HSF细胞没有保护作用，其余22组类胡萝卜素组合均可显著增加细胞存活率，表明对UVA诱导HSF细胞氧化损伤的具有较强的保护作用。

表1 不同类胡萝卜素组合对HSF细胞存活率的影响Tab. 1 The effects of different carotenoids groups on HSF cell survival rate

此外，当虾青素为5.0、15.0 µg/mL，β-胡萝卜素为0.5、5.0 µg/mL时或虾青素为15.0 µg/mL，β-胡萝卜素为10.0 µg/mL时，不同类胡萝卜素组合的细胞存活率基本随海胆酮质量浓度的增加呈上升趋势；当虾青素为5.0 µg/mL，β-胡萝卜素为10.0 µg/mL时，不同类胡萝卜素组合的细胞存活率随海胆酮质量浓度的增加呈下降的趋势；当虾青素为20.0 µg/mL，β-胡萝卜素为0.5 µg/mL时，不同类胡萝卜素组合的细胞存活率随海胆酮质量浓度的增加而下降；当虾青素为20.0 µg/mL，β-胡萝卜素为5.0 µg/mL或10.0 µg/mL时，不同类胡萝卜素组合的细胞存活率随海胆酮质量浓度的增加均先降低后增加。

2.5 类胡萝卜素对UVA辐照HSF细胞中LDH活性和MDA含量的影响

类胡萝卜素对UVA辐照HSF细胞中LDH活性和MDA含量的影响如图9和图10所示。与空白组相比，经UVA辐照的对照组的LDH活性、MDA含量均显著增加（P＜0.05），分别为（0.142 0±0.016 7）U/104cell和（0.083 5±0.013 6）nmol/104cell，表明辐照诱导HSF细胞产生氧化损伤。与对照组相比，单一类胡萝卜素虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮和三者组合的类胡萝卜素分别作用于UVA氧化损伤的HSF细胞，均可使LDH活性和MDA含量显著降低（P＜0.05），说明类胡萝卜素均可减轻UVA辐照对HSF细胞的氧化损伤，对HSF细胞具有一定的保护作用。

由图9可知：在单一类胡萝卜素试验组中，当虾青素、β-胡萝卜素均为5.0 µg/mL时，其LDH活性分别为（0.042 3±0.004 9）U/104cell和（0.061 2±0.013 2）U/104cell，表明虾青素对损伤细胞的保护作用强于β-胡萝卜素；当虾青素、海胆酮均为15.0 µg/mL时，其LDH活性分别为（0.039 8±0.004 5）U/104cell、（0.059 3±0.010 1）U/104cell，表明虾青素对损伤细胞的保护作用强于海胆酮；当β-胡萝卜素和海胆酮均为0.5、10.0 µg/mL时，β-胡萝卜素的LDH活性均显著高于海胆酮（P＜0.05），表明海胆酮对损伤细胞的保护作用强于β-胡萝卜素。因此，虾青素对UVA辐照引起HSF细胞氧化损伤具有最强的保护作用，β-胡萝卜素对HSF细胞氧化损伤的保护作用最弱。β-胡萝卜素和海胆酮均在中质量浓度时LDH活性最低，而不同质量浓度虾青素作用后的LDH活性没有显著性差异（P＞0.05）。20.0 µg/mL虾青素、0.5 µg/mL β-胡萝卜素和0.5 µg/mL海胆酮组合作用后的LDH活性为（0.052 8±0.018 9）U/104cell（试验组10），20.0 µg/mL虾青素的LDH活性为（0.041 3±0.004 5）U/104cell，显著低于组合组（P＜0.05），而0.5 µg/mL β-胡萝卜素和海胆酮的LDH活性分别为（0.072 4±0.007 0）U/104cell、（0.058 9±0.005 9）U/104cell，显著高于组合组（P＜0.05），表明20.0 µg/mL虾青素对损伤细胞的保护作用高于组合组，而0.5 µg/mL β-胡萝卜素和海胆酮对损伤细胞的保护作用均低于组合组。

图9 不同样品对HSF细胞中LDH活性的影响Fig. 9 The effects of different sample on LDH activity in HSF cells

由图10可知：在单一类胡萝卜素试验组中，当虾青素、β-胡萝卜素均为5.0 µg/mL时，其MDA含量分别为（0.049 7±0.003 9）nmol/104cell、（0.047 4±0.003 2）nmol/104cell，两者无显著性差异（P＞0.05）；当虾青素、海胆酮均为15.0 µg/mL时，其MDA含量分别为（0.039 3±0.002 9）nmol/104cell、（0.049 7±0.001 3）nmol/104cell，两者无显著性差异（P＞0.05）；当β-胡萝卜素和海胆酮均为0.5 µg/mL和10.0 µg/mL时，虽然β-胡萝卜素的MDA含量均高于海胆酮，但无显著性差异（P＞0.05）。因此，虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮三者对UVA辐照引起HSF细胞氧化损伤的MDA含量均没有显著性差异（P＞0.05）。此外，虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮均在中质量浓度时MDA含量最低，但不同质量浓度类胡萝卜素作用后的MDA含量没有显著性差异（P＞0.05）。20.0 µg/mL虾青素、0.5 µg/mL β-胡萝卜素和0.5 µg/mL海胆酮组合作用后的MDA含量为（0.045 5±0.001 3）nmol/104cell（试验组10），20.0 µg/mL虾青素作用后的MDA含量为（0.044 8±0.001 9）nmol/104cell，0.5 µg/mL β-胡萝卜素和海胆酮作用后的MDA含量分别为（0.052 7±0.003 2）nmol/104cell、（0.051 3±0.004 8）nmol/104cell，均与组合组没有显著性差异（P＞0.05），但20.0 µg/mL虾青素对损伤细胞的保护作用高于组合组，而0.5 µg/mL β-胡萝卜素和海胆酮对损伤细胞的保护作用均低于组合组。

图10 不同样品对HSF细胞中MDA含量的影响Fig. 10 The effect of different sample on MDA content in HSF cells

综上所述，各组分均可减少UVA辐射对细胞的毒性，对细胞损伤具有一定的保护作用。所有试验组中，15.0 µg/mL虾青素的LDH活性和MDA含量均最低，对UVA辐照引起HSF细胞氧化损伤的保护作用最强；10.0 µg/mL β-胡萝卜素的LDH活性和MDA含量均最高，对UVA辐照引起HSF细胞氧化损伤的保护作用最弱。并且，相对于β-胡萝卜素和海胆酮来说，三种类胡萝卜素组合对细胞损伤的保护具有协调作用，但对于虾青素来说，类胡萝卜素组合组对细胞的保护作用小于其单独作用，具有负协调作用。

3 讨论

紫外线主要通过诱导皮肤产生氢氧根离子、过氧化氢、单线态氧和超氧阴离子等导致HSF细胞的氧化损伤［15］。类胡萝卜素是由碳碳共轭键链组成的多烯碱，可以通过促进电子的自由移动并与未配对的电子组合，淬灭自由基和单线态活性氧，发挥抗氧化作用，达到保护和阻遏HSF细胞氧化性损伤的作用［16］。

LDH是人体能量代谢过程中重要的酶，可以通过检测LDH活性判断细胞的损伤程度。LDH活性越大，细胞破坏损伤的程度越大，通透性越大。MDA是氧自由基攻击细胞后产生的脂过氧化物，具有一定的细胞毒性，能破坏细胞的结构和功能，MDA含量越高，表明体内脂质过氧化的程度越大［17］。本文将虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮和三者以一定质量浓度组合后作用于经UVA辐照氧化损伤的HSF细胞，通过测定LDH活性和MDA含量，研究类胡萝卜素对UVA氧化损伤HSF细胞的保护作用。结果表明，单一类胡萝卜素虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮和三者组合的类胡萝卜素均显著降低UVA辐照的HSF细胞的LDH活性和MDA含量（P＜0.05），说明类胡萝卜素可减轻UVA辐照对HSF细胞的氧化损伤，对HSF细胞具有保护作用，这与Lyons等［18］的研究结果一致。据文献报道，具有抗氧化作用的虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮主要通过直接清除自由基，阻止自由基反应对细胞膜的损伤，从而降低LDH活性和MDA含量［19-21］。虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮按一定质量浓度组合后的LDH活性低于同等质量浓度的β-胡萝卜素和海胆酮，说明不同类胡萝卜素具有协同作用。已有研究表明，类胡萝卜素虾青素和β-胡萝卜素具有协同抗氧化作用［21］；另外，虾青素与维生素C对过氧化氢和UVB照射建立的氧化应激模型同样具有协同抗氧化作用［22］。相同质量浓度下，虾青素降低LDH活性优于β-胡萝卜素，表明虾青素对细胞氧化损伤的保护效果较好，这可能是因为虾青素的抗氧化能力高于β-胡萝卜素［21］。此外，Komatsu等［23］报道，食用虾青素可以抑制由UVA辐射引起的皮肤屏障功能受损和皱纹等光老化现象，而且所食用的虾青素会在皮肤中积累，可预防UVA照射对表皮和真皮中聚丝蛋白代谢和脱屑的影响。

综上可知，虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮可减轻UVA对HSF细胞的氧化损伤。本文的研究结果为应用类胡萝卜素开发对UVA辐射氧化损伤具有保护作用的化妆品和保健品提供了理论依据和支持。