不同干燥方式下叶蛋白-辣椒素微胶囊理化特性研究

秦庆雨 李宇宇 李文虎 高 冰 韩鲁佳 刘 贤

(中国农业大学工学院， 北京 100083)

0 引言

近年来，世界辣椒产业发展迅速[1]，但辣椒叶作为副产品利用率却十分低下，长期作为农业废弃物被掩埋和焚烧，造成严重的环境污染与资源浪费[2]。辣椒叶中粗蛋白质量分数为20%～31%，氨基酸组成基本符合FAO/WHO推荐值，经分离纯化后可成为重要资源。但提纯后的蛋白质不稳定，需冷冻贮藏，生产成本大幅增加[3]。辣椒素(Capsaicin，Cap)作为辣椒果实中主要辛辣成分，具有抗氧化、抑菌、镇痛等多种生物活性[4]，但其属于热不稳定性酰胺类化合物，易挥发且具有刺激性味道，限制了其在食品领域的应用[5]。因此，探究辣椒叶蛋白和辣椒素的加工应用是辣椒产业发展的热点问题。

微胶囊技术是食品加工领域的重要手段，因具有保护不稳定性成分、降低挥发性等特点而被广泛应用[6-7]。文献[8]采用喷雾干燥法，以明胶为壁材，通过优化高压均质及混合剪切工艺得出稳定性强、包埋率高的β-胡萝卜素包埋产品，显著提高了其热稳定性；文献[9]以乳清蛋白、麦芽糊精及阿拉伯胶为组合壁材，采用真空冷冻干燥法实现南瓜籽油封装，探究了壁材的相互协同作用对水包油乳液流变性及微胶囊理化特性的影响；文献[10]以大豆分离蛋白和海藻酸钠为复合壁材，采用复凝聚法对紫苏油进行包埋，优化出最佳工艺参数，显著提升了紫苏油的储存便捷性；文献[11]以大豆分离蛋白和磷脂酰胆碱为壁材，采用超声技术制备纳米乳液，并通过喷雾、真空冷冻及微波干燥法制备微胶囊，发现喷雾干燥法制备的鱼油微胶囊产品性能更优。

蛋白质为天然高分子壁材，是制备微胶囊的优选材料[12-13]，采用叶蛋白包埋辣椒素，不仅解决了辣椒叶蛋白资源浪费问题，同时也可弥补辣椒素的不稳定性缺陷。但将叶蛋白与辣椒素结合制备微胶囊技术目前还鲜有报道。由于辣椒素的溶解性低、热敏性强，不适合复凝聚和微波干燥法包埋，因此，本文以辣椒素为芯材，辣椒叶蛋白为壁材，分别采用喷雾和真空冷冻干燥法制备叶蛋白-辣椒素微胶囊，用作天然生物抑菌保鲜剂。并利用扫描电镜、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱、热重分析、粒径分析及高效液相色谱等技术手段对微胶囊的微观结构、晶体结构、化学键、热稳定性、粒径及包埋率的变化情况进行综合分析，探究干燥方式对微胶囊微观结构与性能的影响机理，确定最佳包埋工艺方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

羊角椒植株鲜叶(湿基含水率72%)，河北省鸡泽县；辣椒素(纯度97%)、氢氧化钠(分析纯)，麦克林生化科技有限公司；浓盐酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、四氢呋喃，美国赛默飞世尔科技公司；所有试验用水均为去离子水。

PHG-9132A型恒温干燥箱，上海精宏试验设备有限公司；Retsch ZM200型粉碎机，德国莱驰公司；SK8210HP型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；MS-H-S10型磁力搅拌器，北京大龙兴创试验仪器股份公司；ALPHA 1-2 LD plus型真空冷冻干燥机，德国Marin Christ公司；SD-06AG型喷雾干燥机，英国Labplant公司；SU3500型场发射扫描电子显微镜，日本HITACH公司；D8 Advance型X射线衍射仪，德国Bruker公司；Spectrum 400型傅里叶变换红外光谱仪，美国PerkinElmer公司；SDT Q600型热重分析仪，美国TA公司；Marstersizer 3000型激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；Waters e2695型高效液相色谱仪、Waters 2489型紫外-可见分光光度检测器，英国Waters公司。

1.2 叶蛋白提取

参照文献[14]的超声预处理碱融酸沉法提取辣椒叶蛋白，略有改动。取适量辣椒鲜叶于60℃恒温干燥箱内干燥至质量恒定，经粉碎过40目筛得到辣椒叶粉。准确称取12.5 g辣椒叶粉于锥形瓶内，以液料比20 mL/g加入250 mL浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液，搅拌混匀后置于超声波清洗器内以功率500 W超声处理15 min，保证水浴温度为35℃，取出后置于磁力搅拌器上，35℃恒温搅拌1.5 h以达到充分碱提，然后将混合溶液置入离心机内，在转速4 000 r/min下离心15 min，收集上清液，用浓度为0.1 mol/L的HCl溶液不断调节上清液pH值，至出现絮状沉淀，4 000 r/min下离心30 min，弃去上清液，收集沉淀置于真空冷冻干燥机内在压力0.1 MPa、温度-42℃条件下冻干，收集冻干后的叶蛋白粉末，置于-80℃冰箱内冷藏待用。

1.3 叶蛋白-辣椒素微胶囊制备

根据前期研究经验，壁材浓度过高，容易导致喷雾干燥过程进料管及喷头堵塞；芯材浓度过高容易造成辣椒素溶解率低、包埋不彻底及加工过程刺激性气味强烈现象。故考虑实际应用及前期预试验的工艺条件，所用芯壁质量比为1∶4，壁材质量浓度为0.06 g/mL，参照文献[15]的方法制备叶蛋白辣椒素微胶囊，略有改动。首先准确称取6 g叶蛋白粉末，溶于50 mL超纯水中。由于辣椒素不溶于水，其溶于有机溶剂和氢氧化钠溶液，故称取1.5 g辣椒素标准品(纯度97%)溶于50 mL浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液，45℃恒温水浴状态下超声处理20 min促进溶解。将辣椒素溶液加入到蛋白质溶液中，45℃恒温水浴2 h并不断搅拌，形成粗乳液，利用均质机以转速10 000 r/min常压均质5 min得到叶蛋白-辣椒素乳状液，将乳状液经喷雾干燥和真空冷冻干燥处理后即可得到微胶囊。

1.4 乳状液喷雾干燥

将所得乳状液在进料速度8 mL/min、进风温度140℃、出风温度105℃条件下喷雾干燥，即可得到辣椒素包合物，具体方法见文献[16]。

1.5 乳状液冷冻干燥

将所得乳状液装入玻璃培养皿中，乳液厚度不超过1 cm，用保鲜膜封住，放入-80℃冰箱中预冷冻12 h，采用真空冷冻干燥机，在压力0.1 MPa、温度-42℃条件下真空冷冻干燥24 h[17]，即可得到辣椒素微胶囊。

1.6 叶蛋白-辣椒素微胶囊微观结构表征分析

1.6.1扫描电子显微镜分析

微胶囊的结构特征影响着其理化性质，而扫描电子显微镜是研究微胶囊表面结构最常用的有效工具。故采用扫描电子显微镜观察叶蛋白-辣椒素微胶囊粉末的表面微观形态，在样品台上贴一层导电双面胶，使样品均匀分布在导电胶上，然后用洗耳球轻轻吹去多余粉末，放入离子溅射仪中在真空条件下进行喷金处理，将样品台固定于载物台上，在加速电压15 kV、放大倍数1 000的条件下进行观察并拍照。

1.6.2X射线衍射分析

X射线衍射法是测定生物大分子结构的经典方法，因具有操作便捷、精度高、无损检测等特点而被广泛应用。粉末状的物料分为晶型结构、半晶型结构及非晶型结构，当X射线照射长程无序、短程有序的非晶型结构时，不存在明显的衍射光栅，呈现出类似馒头峰的衍射线条。蛋白质和辣椒素的晶体结构不同，因此，X射线衍射法可以用来研究叶蛋白-辣椒素微胶囊样品的结构与包埋完整性。故参考文献[18]略有改动，采用X射线衍射仪分析样品的结晶度差异性，其中特征衍射线为Cu靶(Kα射线，波长1.540 56 nm)、管压为36 kV、电流为20 mA、测量角度2θ为5°～80°、步长为0.02°、扫描频率为2(°)/min，利用MDI-Jade 6.0 软件对X射线衍射图谱进行数据分析。

1.6.3傅里叶变换红外光谱分析

红外光谱技术是生物高分子结构分析的有力工具，可对物料官能团及化学键进行表征。故采用傅里叶变换红外光谱仪对样品进行官能团特征分析，参照文献[19]略有改动，将光谱级溴化钾和待测样品分别经玛瑙研钵充分研磨后，以质量比1∶100混匀，称取150 mg混合试样，采用压片机在压制压力40 MPa条件下保压1.5 min，制成透明薄片。检测时，选用空白溴化钾片作为对照，红外分析扫描范围为400～4 000 cm-1，扫描次数为32次，分辨率为4 cm-1。

1.6.4热重分析

热重分析仪可用于测定样品的热解温度和速率，评价不同物质的热稳定性，且不同的热降解阶段可以通过微商热重曲线的显著峰值来区分。因此，热重法是探明干燥方式对叶蛋白-辣椒素微胶囊热稳定性影响的重要手段，故采用热重分析仪对样品进行热解特性试验。参照文献[20]略有改动，将待测样品经充分研磨后，称取5～6 mg于坩埚中，进行热重分析(TGA)，其中氮气流速为100 mL/min，升温速率为10℃/min，升温范围为30～700℃。

1.6.5微胶囊的粒度分布

通过激光粒度仪对微胶囊粒度分布进行测定。参照文献[21]的方法，并略有改动。使用超纯水为分散剂，取适量样品溶解，设置仪器压力为0.15 MPa，材料折射率为1.47，水分散剂折射率为1.33，吸收率为0.1，泵转速为2 000 r/min，将微胶囊载体溶液逐滴加入到分散剂中，直至遮光度达到适宜测定范围，测定样品的粒度分布，每组样品进行3次重复测定。

1.6.6微胶囊包埋率测定

包埋率的测定需先分别测量微胶囊总辣椒素含量和微胶囊表面辣椒素含量，总辣椒素含量可依据GB/T 21266—2007测定，所用分离柱为SunFire C18柱(5 μm，4.6×250 mm)，柱温为30℃，检测波长为280 nm，流动相为甲醇和水(体积比80∶20)，流量为0.8 mL/min，进样量为10 μL。在上述确定的色谱条件下进行含量分析，峰面积与辣椒素质量浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=7 087.3X-9 047.7，R2=0.999 2。

微胶囊表面辣椒素含量测定参照文献[22]方法，并略有改动。首先准确称取0.02 g微胶囊样品，溶解于25 mL色谱级甲醇中，充分摇匀振荡1 min，然后在5 000 r/min下离心5 min，取1 mL上清液于5 mL容量瓶内，用甲醇定容，经滤膜过滤后进行色谱分析，色谱分析条件同上。

微胶囊的包埋率计算公式为[8]

式中α——微胶囊表面辣椒素质量分数，%

β——微胶囊总辣椒素质量分数，%

1.7 统计分析

采用SigmaPlot 14.0对试验结果进行处理；所有试验均为3次重复试验，采用SPSS 18.0软件对试验结果进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 干燥方式对物料微观结构的影响

不同干燥方式下辣椒素微胶囊粉末扫描电镜图如图1所示。由图1可知，辣椒素标准品原样与真空冷冻干燥处理后的表面微观结构差异不大，喷雾干燥处理后叶蛋白表面有褶皱和凹陷现象。这与喷雾干燥的雾化过程相关，雾化器将蛋白溶液分散成小液滴与热空气接触，物料水分迅速蒸发，表面张力急剧增加，因而形成凹陷的不规则表面[23]。而喷雾干燥处理后的乳状液，其辣椒素被完全包裹在叶蛋白内部，故微胶囊呈球状结构。真空冷冻干燥处理后的微胶囊表面呈现大小不一的片状化结构，这一结果与文献[24]对姜黄素微胶囊的研究结果一致。这是由于真空冷冻干燥条件下乳液在预冻过程中会形成冰晶体，破坏原有结构，在分子间作用力下，更易导致溶质聚合，因而辣椒素微胶囊呈现大片层结构。由此可知，干燥方式对辣椒素微胶囊的表面微观形态影响显著。相比而言，球状结构包覆芯材不仅能够减小辣椒素的挥发速率，还可达到缓释杀菌功效。

图1 不同干燥工艺下辣椒素、叶蛋白及其微胶囊的扫描电镜图Fig.1 SEM images of capsaicin, leaf protein and microcapsules under different drying processes

2.2 干燥方式对物料晶体结构的影响

由图2可知，辣椒素标准品在10°～30°范围内出现大量的2θ衍射峰，这是其晶体结构的典型特征[25]。经超纯水溶解和均质后冻干得到的辣椒素粉末其衍射峰强度有所减弱，并且衍射峰的位置发生少许移动，这是由于经溶解均质后辣椒素粉末粒径变小且冻干过程自由水形成冰晶，破坏了其原有的晶体结构。叶蛋白原样和喷雾干燥处理后具有相似的X射线衍射图谱，在2θ=20°附近都呈现出弥散的宽峰，这表明两种蛋白粉末均未形成晶体结构，与文献[26]对大豆分离蛋白粉的研究结果一致。经喷雾干燥得到的微胶囊在图中也呈现出弥散衍射峰特征，为明显的非晶型结构，这表明辣椒素被完全装载到叶蛋白中，而不是物理混合到叶蛋白中，证明微胶囊制备成功。虽然晶型结构比非晶型结构在储存时更加稳定，但由于制备出的微胶囊为粉末状，非晶型结构的粉末在低含水率保存时具有更好的溶解性，这为后续微胶囊的应用打下基础。经真空冷冻干燥得到的微胶囊在呈现弥散衍射峰的同时在11.7°和23.6°两处具备尖峰，这是辣椒素的衍射峰，其原因是真空冷冻干燥工艺下，随温度降低辣椒素溶解性下降，容易析出，且冰晶在真空冷冻干燥时升华后留下孔道，故辣椒素不能完整包埋，而喷雾干燥条件下微胶囊呈典型球状结构，芯材包埋效果好，故不存在这一现象。

图2 不同干燥工艺下辣椒素、叶蛋白及其微胶囊的X射线衍射图谱Fig.2 X-ray profiles of capsaicin, leaf protein and microcapsules under different drying processes

2.3 不同干燥方式下物料红外光谱分析

图3 不同干燥工艺下辣椒素、叶蛋白及其微胶囊的红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of capsaicin, leaf protein and microcapsules under different drying processes

2.4 干燥方式对物料热稳定性的影响

图4 不同干燥工艺下辣椒素、叶蛋白及其微胶囊的热重分析曲线Fig.4 TGA curves of capsaicin, leaf protein and microcapsules under different drying processes

微胶囊的热稳定性决定了微胶囊的缓释特性，故探究不同干燥方式下微胶囊热稳定性对其工业化应用具有重要意义。不同样品的TG和DTG曲线如图4所示。由图4可知，除辣椒素标准品外，其余样品在60℃左右由于水分的汽化，样品质量分数均呈先下降后平稳趋势，500℃以上的残余质量归因于原料热降解产生的无机化合物[26]。其中辣椒素标准品是单一组成，故其热降解过程并不复杂，只在216～370℃呈现一段热重曲线，最大失重速率发生在315℃附近，这是由于辣椒素是热不稳定的酰胺类化合物，在较高温度下具有挥发性，导致其迅速失重，故质量分数仅5.63%。经真空冷冻干燥处理后的辣椒素粉末热稳定性降低，最大失重速率发生在260℃，这是由于其微观结构发生改变，粒径变小，相同质量辣椒素粉末表面积大幅增加，更易挥发。叶蛋白粉末在130～500℃迅速降解，样品质量大幅下降，这与蛋白质的碳化过程相对应[30]。喷雾干燥处理后的叶蛋白热稳定性有所增加，最大失重速率峰被延长至250℃，这是由于喷雾干燥处理后，叶蛋白微观结构呈球状，结构致密，发生相转变所需温度和能量较高。不同干燥方式下微胶囊热稳定性均有所提高，具有较强的耐热性，表明微胶囊化处理后可提高辣椒素的热稳定性。同时由图4可知，喷雾干燥处理得到的微胶囊热稳定更高，具有优异性，且叶蛋白的热稳定性低于辣椒素，随温度增加，叶蛋白先降解，保证了辣椒素的成功释放，故叶蛋白作为壁材包埋辣椒素生产微胶囊这一方法可行。

2.5 干燥方式对物料粒径分布的影响

微胶囊的粒径及其分布状态是微胶囊产品品质的重要参数，粒径越小，越易于包埋物的释放[31]。不同干燥工艺下微胶囊体积平均粒径如表1(表中D10表示粒径小于该值的颗粒占10%，D50表示粒径小于该值的颗粒占50%，D90表示粒径小于该值的颗粒占90%)所示，由表1可知，冷冻干燥辣椒素、喷雾干燥叶蛋白相较辣椒素、叶蛋白体积平均粒径降低，这是由于均质过程中剪切力和湍流能够显著降低样品的粒径[32]。喷雾干燥工艺相比冷冻干燥工艺所得样品D90变化显著，其原因是在喷雾干燥过程中，物料需经雾化处理，液滴粒径较小，故所得样品粒径小。

表1 不同干燥工艺下辣椒素、叶蛋白及其微胶囊的平均粒径Tab.1 Average particle size of capsaicin, leaf protein and microcapsules under different drying processes μm

图5 不同干燥工艺下辣椒素、叶蛋白及其微胶囊的粒径分布图Fig.5 Particle size distribution of capsaicin, leaf protein and microcapsules under different drying processes

不同干燥工艺下微胶囊粒径分布如图5所示。由图5可知，不同处理方式下的物料粒径基本呈正态分布并且较为狭窄，说明所得样品粒径较为均匀，分散性良好。但喷雾干燥叶蛋白样品呈现出多个峰，这可能与物料表面的静电作用有关，致使颗粒间发生相互聚集，这与微观结构观察结果相一致，同时干燥过程中温度较高，易导致蛋白质变性，所得蛋白粉末易粘连结块，故喷雾干燥所得蛋白粉末相比微胶囊粉末体积平均粒径大，粒径分布不均。

2.6 干燥方式对微胶囊包埋率的影响

不同干燥方式下微胶囊包埋率如表2所示。由表2可知，喷雾干燥所制备的微胶囊包埋率高达90.38%，相较真空冷冻干燥高4.95个百分点，且表面辣椒素含量最低，这是由于在喷雾干燥过程中，乳液雾化成小液滴，内层芯材被外表面水相包裹，外层水相遇高温气流迅速挥发形成一层保护膜，且叶蛋白具有较好的成膜性对其微胶囊结构的形成有促进作用，故其表面芯材含量降低，包埋率升高。而对于真空冷冻干燥，预冷冻过程易使乳液内部水分形成冰晶，破坏了乳液经均质过程在芯材外层形成的液态膜，且随干燥进行，冰晶不断升华，表面结构遭到破坏呈现酥松多孔状，致使局部芯材暴露，表面辣椒素含量增加，包埋率下降[33]。喷雾干燥法获得微胶囊总辣椒素含量相较真空冷冻干燥略降低，这是由喷雾干燥过程中，为降低物料损失率，减缓粉末挂壁现象，设置的流速较低，溶液经长时间静置，辣椒素部分沉淀析出所致。

表2 不同干燥工艺下叶蛋白-辣椒素微胶囊的包埋率Tab.2 Entrapment efficiency of leaf protein-capsaicin microcapsules under different drying processes %

3 结论

(1)以辣椒叶蛋白为壁材，辣椒素为芯材，探究不同干燥方式对叶蛋白、辣椒素及其微胶囊的微观结构和理化特性变化规律。利用扫描电子显微镜对其微观结构观察可知，喷雾干燥法制得的微胶囊微观形貌呈完整球状结构，而真空冷冻干燥下的微胶囊呈现形状不一的片状化结构。X射线衍射分析表明，不同干燥方式下微胶囊粉末均呈弥散衍射型特征峰，无晶体结构，说明辣椒素被成功胶囊化。

(2)傅里叶变换红外光谱分析表明不同干燥方式下微胶囊制备过程均未发生化学反应，辣椒素被成功包埋。热重分析结果表明不同干燥方式制备的微胶囊热稳定性均有所提高，且叶蛋白的热稳定性低于辣椒素，可保证应用过程中辣椒素的成功释放。粒径分析结果表明不同处理方式下的物料粒径分布均匀，基本呈正态分布且较为狭窄。

(3)高效液相色谱分析表明喷雾干燥法和真空冷冻干燥法所得微胶囊包埋率分别为90.38%、85.43%，但喷雾干燥法所得微胶囊粒径更小，易于活性成分的释放，且热稳定性高于真空冷冻干燥法，综合效果最佳，具有作为一种新型天然生物抑菌保鲜剂应用到食品领域的潜力。