虾青素通过激活MAPK信号通路诱导睾丸生殖细胞瘤细胞凋亡和自噬

梁少奎,阳国梁,胡 慧,徐 越,肖 沛,罗梓玉,周 畅*

(1.湖南师范大学生命科学学院省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,中国湖南 长沙 410081;2.广西南宁市天桃实验学校,中国广西 南宁 530216;3.湖南财政经济学院,中国湖南 长沙 410205)

睾丸生殖细胞瘤(testicular germ cell tumor,TGCT)在人群中是一种相对罕发癌症,但在15～35岁男性中却是比较常见的恶性肿瘤之一[1]。目前,其治疗方法主要采取手术与化疗、放疗相结合的方式。虽然睾丸生殖细胞瘤的治愈率很高,但患者术后患继发性肿瘤的概率比较高,且放、化疗可能会导致不育等并发症[2～4],同时还易产生顺铂抗性等副作用[5],因此急需寻找更安全的治疗手段。天然药物提取物具有不良反应小、作用独特、研究成本低的特点。当前,很多天然药物提取物的抗肿瘤机制研究取得了突破性进展,并已作为抗肿瘤药或抗肿瘤辅助药得到广泛的应用,例如:Li等[6]发现槲皮素可以通过上调Bax/Bcl-2比例,以及上调p53和Fas,诱导细胞凋亡;Lü等[7]在乳腺癌新辅助治疗方案的回顾性研究中发现,结合紫杉醇的辅助治疗具有较好的疗效。

虾青素(astaxanthin,AST)是一种从虾蟹外壳以及藻类等海洋生物中提取的红色天然类胡萝卜素[8],化学名称为 3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素,分子式为C40H52O4,具有极强的抗氧化性[9]、抗炎和抗肿瘤等多种生物学功能[10～12]。前期文献报道,虾青素对黑色素瘤细胞、结直肠癌细胞、口腔癌细胞等都具有生长抑制效应[13～15],但关于虾青素对睾丸生殖细胞瘤的影响及其可能的分子调控机制目前尚未见报道。本研究以睾丸生殖细胞瘤细胞系NCCIT和NT2为研究对象,观察虾青素作用后,细胞的生长情况,探究虾青素对NCCIT和NT2细胞凋亡和自噬的影响,并探讨其对丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)通路的调控作用,为睾丸生殖细胞瘤防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

睾丸生殖细胞瘤细胞系NCCIT和NT2均购自上海中科院细胞库。

虾青素(分析对照品,UV≥98%,100 mg,批号A9692E769,购自上海Acmec公司)溶解于1,2-丙二醇(上海生工生物工程股份有限公司);胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司;PVDF膜购自美国 Millipore 公司。GAPDH、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶-3(caspase-3)的单克隆抗体购自英国Abcam 公司;Beclin1、LC3、p38、p-p38、细胞外信号调控的激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p-ERK的抗体购自美国Cell Signal Technology公司;c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p-JNK、多聚 ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)的抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;二抗goat anti-rabbit和goat anti-mouse购自北京西美杰科技有限公司。其余常规试剂均购自上海生工生物工程股份有限公司。

本研究使用的仪器主要有:FACSCalibur流式细胞仪(BD公司,美国);荧光显微镜Axioskop 2 plus Zeiss(Zeiss公司,德国);Multiskan FC酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司,美国);Tanon 5200-Multi凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);SXZX16荧光体式显微镜(OLYMPUS公司,日本)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及处理

将NCCIT、NT2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基置于细胞培养箱(5% CO2,37℃)中培养,待细胞生长至90%左右,用0.2%胰酶消化传代。取对数生长期NCCIT、NT2细胞,用胰酶消化离心后重悬细胞,调整细胞密度为1×105mL-1,铺板24 h后,将其分为空白对照组和3个不同处理浓度的实验组。空白对照组细胞不做任何处理(预实验显示含丙二醇的溶剂组与不含任何试剂的空白组的实验结果差异不明显,故仅设一组空白组为对照组),实验组细胞分别加入终浓度为0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmo/L的虾青素。

1.2.2 MTT法检测虾青素对NCCIT、NT2细胞增殖的影响

细胞分组及处理同1.2.1。具体检测步骤按照文献[16]的方法,其中,将细胞接种于96孔板,同时设4个复孔,处理时间分别为24 h、48 h、72 h。用酶标仪测定每孔490 nm处的光密度值(OD值)。用如下公式计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。

1.2.3 台盼蓝拒染法检测虾青素对NCCIT、NT2细胞活力的影响

具体操作按照文献[17]的方法。实验分空白对照组和虾青素实验组,虾青素处理浓度为0.2 mmol/L,处理时间分别为24 h、48 h、72 h。用如下公式统计细胞活率:活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.2.4 细胞克隆形成检测虾青素对NCCIT细胞生长的影响

NCCIT细胞分组及处理同1.2.1。具体检测步骤按照文献[18]的方法,其中,细胞以1 000个/孔接种于6孔板。统计细胞克隆数(含≥50个细胞数)后用如下公式计算克隆形成率:克隆相对形成率(%)=(实验组克隆数/空白对照组克隆数)×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色法检测细胞形态变化

实验分空白对照组和虾青素实验组,虾青素处理浓度为0.2 mmol/L,加药处理24 h后,按照文献[19]的方法进行后续操作。

1.2.6 流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

细胞分组及处理同1.2.1。药物处理24 h后,按照文献[20]的方法进行后续操作,最后进行凋亡率的计算分析。

1.2.7 Western-blot检测蛋白质表达

细胞分组及处理同1.2.1。加药处理24 h后,按照文献[20]的方法进行后续操作,检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和PARP、自噬相关蛋白质Beclin1和LC3的表达水平,以及MAPK信号通路相关蛋白质(JNK、p38和ERK)及其磷酸化水平。用ImageJ软件分析蛋白质条带灰度值,以GAPDH为内参,计算目的蛋白的相对表达水平。

1.2.8 统计学分析

2 结果

2.1 虾青素抑制NCCIT、NT2细胞增殖

为了检测虾青素对睾丸生殖细胞瘤细胞增殖的影响,采用不同浓度的虾青素(0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L)对 NCCIT 和 NT2 细胞进行处理,通过MTT、台盼蓝拒染和细胞克隆形成实验检测细胞的增殖情况。MTT法检测结果如图1A所示,与空白对照组相比,虾青素以剂量和时间依赖性抑制NCCIT和NT2细胞增殖。虾青素处理 72 h时,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L 虾青素实验组中NCCIT细胞的存活率分别为(81.10±6.74)%、(63.77±5.27)%和(53.75±5.34)%;NT2细胞的存活率分别为(66.59±10.81)%、(42.87±9.91)%和(18.65±2.75)%,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。台盼蓝拒染实验结果如图1B所示,与空白对照组相比,虾青素(0.2 mmol/L)处理可明显降低NCCIT、NT2细胞活性。其中,虾青素处理72 h时,NCCIT和NT2细胞的活力分别为(60.61±3.61)%和(52.57±4.41)%,与空白对照组比较均有显著差异(P<0.01)。MTT和台盼蓝拒染实验结果均提示,NCCIT细胞较NT2细胞对虾青素的耐受性更强。因此,我们用NCCIT细胞进行细胞克隆形成实验,结果如图1C所示:随着虾青素处理浓度增加,细胞克隆形成能力降低,且与空白对照组比较,实验组的克隆形成率差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

图1 虾青素抑制NCCIT、NT2细胞增殖(A)不同浓度的虾青素(0.1～0.3 mmol/L)处理NCCIT和NT2细胞24 h、48 h、72 h后,MTT法检测细胞增殖率;(B)0.2 mmol/L虾青素处理NCCIT和NT2细胞24 h、48 h、72 h时,台盼蓝拒染法检测细胞活性;(C)不同浓度的虾青素(0.1～0.3 mmol/L)处理NCCIT细胞7～10 d,再用结晶紫染色检测克隆形成数目。数据以3组独立实验得到的平均值±标准差表示;与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;两组间比较采用t检验。图2～4的统计分析同此图。Fig.1 Astaxanthin inhibits proliferation in NCCIT and NT2 cells(A)Cell proliferation rates detected by MTT assay after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h,48 h and 72 h;(B)Cell activities measured by trypan blue dye exclusion after treatment with 0.2 mmol/L astaxanthin for 24 h,48 h and 72 h;(C)Clonogenic growth of NCCIT cells treated with astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 7 to 10 days and stained by crystal violet.Data represent the mean±SD from three separate experiments.*P<0.05 and**P<0.01,compared with control group.Comparison between two groups was performed by t-test.The statistical analysis of the Figs.2～4 is the same as this one.

2.2 虾青素诱导NCCIT、NT2细胞凋亡

0.2 mmol/L虾青素处理24 h后,NCCIT和NT2细胞的形态观察结果如图2A所示,空白对照组细胞形态、大小均正常,虾青素处理组中,NCCIT和NT2均出现细胞体积变小、细胞核荧光强度增高、核固缩等细胞凋亡现象。为量化凋亡比例,使用流式细胞仪检测凋亡率,结果如图2B所示,随着虾青素处理浓度加大,细胞总凋亡率呈递增趋势。在NCCIT细胞中,空白对照组的总凋亡率为(3.82±0.51)%,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L虾青素处理组的总凋亡率分别为(4.98±0.45)%、(8.36±0.65)%、(16.58±2.32)%;在 NT2细胞中,空白对照组的总凋亡率为(8.14±1.32)%,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L虾青素处理组的总凋亡率分别为(15.52±2.62)%、(19.31±0.37)%、(23.43±5.10)%,两个细胞组的结果平行性好,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。进一步采用Western-blot检测凋亡相关蛋白质的表达水平,结果如图2C所示,虾青素处理组与空白对照组相比,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低,而促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和 cleaved PARP的表达水平升高。以上细胞水平和分子水平实验均表明,虾青素能诱导NCCIT、NT2细胞凋亡。

图2 虾青素诱导NCCIT、NT2细胞凋亡(A)0.2 mmol/L虾青素处理NCCIT和NT2细胞24 h后,将细胞固定并用Hoechst33258染色,荧光显微镜下观察细胞形态;(B)不同浓度虾青素(0.1～0.3 mmol/L)处理NCCIT和NT2细胞24 h后,用Annexin V-FITC/PI染色,用流式细胞仪分析细胞凋亡率;(C)不同浓度虾青素(0.1～0.3 mmol/L)处理NCCIT和NT2细胞24 h后,采用Western-blot检测凋亡相关蛋白质的表达水平。Fig.2 Astaxanthin induces apoptosis in NCCIT and NT2 cells(A)Morphology of apoptotic cell nuclei under a fluorescent microscope after cells were exposed to 0.2 mmol/L astaxanthin for 24 h and then stained with Hoechst33258;(B)Apoptosis rates analyzed by flow cytometry after cells were treated with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h and stained with Annexin V-FITC/PI;(C)Expression of apoptosis related proteins in cells analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h.

2.3 虾青素诱导NCCIT、NT2细胞自噬

细胞自噬是细胞程序性死亡方式之一,对维持内环境稳态具有重要作用[21]。Beclin1与自噬体的成熟相关,LC3Ⅱ的表达与自噬小泡发生相关,反映自噬的发生发展程度。虾青素处理细胞24 h后,采用Western-blot检测细胞中自噬相关LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达,结果如图3A所示,LC3的激活体LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达水平随虾青素处理浓度增加而升高,提示虾青素可能诱导NCCIT和NT2细胞发生自噬。

图3 虾青素诱导NCCIT、NT2细胞自噬(A)不同浓度虾青素(0.1～0.3 mmol/L)处理NCCIT和NT2细胞24 h后,采用Western-blot检测自噬相关蛋白质Beclin1和LC3的表达水平;(B)用CQ(1 μmol/L)预处理NCCIT和NT2细胞0.5 h,之后联合虾青素(0.2 mmol/L)共同处理24 h,采用Western-blot检测Beclin1和LC3蛋白的表达水平。Fig.3 Astaxanthin induces autophagy in NCCIT and NT2 cells(A)Expression of Beclin1 and LC3 in cells analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h;(B)Expression of Beclin1 and LC3 analyzed by Western-blot after cells were pretreated with CQ(1 μmol/L)for 0.5 h,and co-incubated with astaxanthin(0.2 mmol/L)for another 24 h.

为明确虾青素诱导LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表达的升高是通过增加自噬体的生成还是抑制自噬体的降解,应用抑制自噬体降解的自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)进行处理。结果如图3B所示,CQ处理促进了虾青素(0.2 mmol/L)诱导的Beclin1表达增加,并显著增加虾青素诱导的LC3Ⅱ表达上调(P<0.01)。以上数据表明,虾青素可诱导NCCIT和NT2细胞发生自噬,且这种作用是通过增强自噬活性使自噬体形成增多实现的,而不是通过抑制自噬体的降解实现的。

2.4 虾青素激活NCCIT、NT2细胞中MAPK信号通路

许多研究证实MAPK信号通路在调节肿瘤细胞生长发育、分化和死亡等生物学过程中具有重要作用[22～23]。本研究通过检测MAPK信号通路中3个主要成员的表达,考察虾青素诱导NCCIT、NT2细胞凋亡和自噬的可能机制。结果如图4所示,与空白对照组相比,虾青素处理组中JNK、p38和ERK的磷酸化水平升高,而JNK、p38和ERK蛋白的相对表达水平无明显差异,表明虾青素可以激活NCCIT、NT2细胞中的MAPK信号通路。

图4 虾青素激活NCCIT、NT2细胞中的MAPK信号通路不同浓度虾青素(0.1～0.3 mmol/L)处理NCCIT和NT2细胞24 h后,采用Western-blot检测JNK/p-JNK、p38/p-p38、ERK/p-ERK蛋白的表达水平。Fig.4 Astaxanthin activates MAPK signaling pathway in NCCIT and NT2 cellsExpressions of JNK/p-JNK,p38/p-p38,ERK/p-ERK in cells were analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h.

3 讨论

传统中药中的活性成分日益受到关注。但是,传统中药成分中大多数活性小分子化合物的药理机制仍不明确,这极大地限制了中药资源的开发利用。因此,利用分子生物学及细胞生物学的研究手段,深入探究天然药物中提取的高活性小分子化合物的抗肿瘤机制是中药现代化开发利用的必需手段。

虾青素已被证明具有强抗氧化性,以及抗肿瘤、抗炎和免疫抑制等多种功能,具有广阔的应用前景。Yasui等[14]的研究结果表明,虾青素可以通过NF-κB信号通路抑制葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的炎症反应,减轻偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和DSS诱导的结肠增生性病变,并减少结肠炎相关性结直肠癌的发生。Kavitha等[24]利用7,12-二甲基苯并(a)蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene,DMBA)诱发仓鼠颊袋肿瘤,并在仓鼠右侧颊袋涂0.5% DMBA诱导肿瘤发生的同时,按照15 mg/kg的剂量在其饲料中添加虾青素进行干预,发现虾青素可以预防肿瘤的产生,其保护作用可能与其激活Nrf2/Keap-1信号通路有关。虾青素在预防肿瘤发生和癌症治疗方面有很好的潜能[10],但是,虾青素抗肿瘤的详细分子机制目前仍未完全阐明。

本研究首先通过绘制细胞生长曲线检测了虾青素对睾丸生殖细胞瘤细胞增殖的影响。结果显示,虾青素对两种细胞增殖有着显著的抑制作用,且这种抑制作用在其浓度低至0.1 mmol/L时依然存在(图1A)。克隆形成实验结果确认,虾青素能抑制NCCIT细胞的存活能力(图1C),0.3 mmol/L虾青素处理组的克隆数与对照组比较下降50%。进一步的细胞形态观察结果显示,0.2 mmol/L的虾青素处理NCCIT、NT2细胞24 h后,细胞形态发生皱缩,甚至变圆脱落,细胞密度显著下降(图2A)。流式细胞术检测结果显示,不同浓度虾青素处理NCCIT、NT2细胞后,细胞凋亡率呈剂量依赖性增高(图2B)。细胞凋亡主要通过caspase通路的级联反应启动。正常情况下,caspase蛋白及PARP以无活性的前体形式存在,当细胞凋亡发生时其会被上一级caspase蛋白切割而活化。因此,caspase和PARP的切割情况可以用来判断细胞是否发生凋亡。本研究发现,用虾青素处理细胞,尤其是高浓度(0.2 mmol/L和0.3 mmol/L)处理时,caspase-3及PARP均能检测到明显的切割条带。同时,虾青素处理组细胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2显著下调,而促凋亡蛋白Bax显著上调。Bax通过与线粒体膜结合,形成渗透性膜转移孔复合物,建立线粒体膜通道,介导促凋亡分子细胞色素C和Smac/Diablo等的释放,从而激活caspase级联反应,并通过caspase-3激活破坏基因组DNA的核酸内切酶,造成基因组DNA裂解,同时失活DNA修复相关酶,造成DNA修复能力降低,在此基础上进一步分解细胞骨架,引起一系列凋亡执行过程的发生。本文研究结果显示,虾青素可以显著提高Bax/Bcl-2的比值,从而促进肿瘤细胞凋亡。该结果与Hormozi等[25]研究虾青素诱导人大肠癌细胞株LS-180细胞凋亡的结果一致。

小分子抗肿瘤药物的细胞毒性一般体现为诱导细胞凋亡、坏死及自噬性死亡。自噬既是细胞的一种自我保护机制,也是一种与凋亡并列的程序性死亡机制。Beclin1是哺乳动物中Atg6的同源蛋白质,是酵母ATG6/Vps30在哺乳动物中的同源物,是介导其他自噬蛋白定位于前自噬泡的关键因子。人类的Beclin1基因位于染色体17q21,其编码产物是启动自噬过程的标志和调节自噬现象的关键蛋白质。Beclin1包含4个重要的结构域,其中包括Bcl-2结合结构域(Bcl-2 homology domains,BH3)。Beclin1作为一种自噬调节因子,同Bcl-2解离的过程可能有两种机制。一是通过BOP蛋白(BH3-only protein)竞争性结合Bcl-2,使二者解离;二是JNK-1磷酸化Bcl-2的多个丝氨酸苏氨酸位点,磷酸化后的Bcl-2蛋白与Beclin1蛋白的结合能力大大减弱,从而分离,分离后的Beclin1与PI3KⅢ/Vps34的相互作用加强,刺激自噬的发生[26]。因此,我们进一步检测虾青素是否影响自噬体形成的标志蛋白质LC3Ⅱ和Beclin1表达。Western-blot结果显示,Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白的表达水平随虾青素处理浓度的升高而增高,并且在联合自噬抑制剂CQ处理后,两种蛋白质的表达水平较虾青素单独处理时显著增加,这表明虾青素诱导睾丸生殖细胞瘤细胞发生自噬。虾青素调控Beclin1和Bcl-2蛋白复合物,诱导细胞凋亡和自噬。

细胞凋亡和自噬的发生受多条信号通路和多种调节因子的作用,MAPK信号通路是主要信号通路之一。MAPK级联激活是多种信号通路的中心,MAPK通路的主要作用是接收膜受体并转换与传递相关信号至细胞核。MAPK信号通路有3个主要家族成员:JNK、p38和ERK。活化的JNK和p38可通过调控与凋亡相关转录因子间接或直接调节Bax、Bcl-2和caspase蛋白,促进细胞凋亡[27～28]。本文的研究结果显示,与空白对照组比较,随着虾青素处理浓度的增加,JNK与p38蛋白的表达水平无显著变化,而p-JNK和p-p38蛋白的表达水平上调,这提示虾青素是通过激活JNK和p38调控凋亡相关蛋白质,从而诱导细胞凋亡。此外,随着虾青素处理浓度的增加,ERK蛋白的表达水平也无显著变化,而p-ERK、剪切的PARP以及Beclin1和LC3Ⅱ的表达水平增加,提示虾青素促进NCCIT、NT2细胞内ERK的磷酸化,可能激活ERK/MAPK通路,活化caspase-3,进而剪切PARP,促进细胞凋亡,同时上调自噬相关蛋白质LC3Ⅱ和Beclin1的表达,从而诱导细胞自噬。

综上所述,本研究的实验结果证实,虾青素通过激活MAPK信号通路诱导睾丸生殖细胞瘤细胞凋亡和自噬。下一步,我们将建立动物实验模型,研究虾青素与低毒性自噬抑制剂联合使用的效果,为虾青素抗肿瘤功效的后期开发利用奠定坚实的理论基础。