竹叶黄酮对萧山鸡公鸡精液品质和血液生理生化指标的影响

阮振婷，王留超，吴志伟，俞奇力，陈 菲，卢立志，刘长国*

（1.浙江农林大学动物科技学院•动物医学院，浙江杭州 311300；2.杭州萧山种鸡（萧山鸡）有限公司，浙江杭州 311200；3.浙江省农科院畜牧兽医研究所，浙江杭州 311000）

种公鸡精液品质的优劣是判断其繁殖性能的重要依据，也是决定种鸡生产效益的关键因素，因此种鸡场必须保证和改善公鸡精液的品质。竹叶黄酮是从竹叶中提取的天然物质，具有多种生物学活性功能，不但能够抗氧化、抗炎、抑菌、调节血栓血脂，还能够保护心脑血管以及肝脏健康。另外，研究表明，竹叶黄酮能够提高家禽的生产性能和免疫功能。因此，本试验旨在研究饲粮中添加不同浓度的竹叶黄酮对公鸡精液品质以及血液生理生化指标的影响，以期为竹叶黄酮应用于种公鸡生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 竹叶黄酮纯度40%（浙江圣氏生物科技有限公司），杆菌肽锌预混剂纯度10%（天津新星制药厂）。

1.2 试验动物及设计 选取健康状况良好、平均体重为（2.35±0.29）kg 的34 周龄萧山鸡公鸡180 只，采用单因素试验设计，将公鸡随机分为6 组，每组6 个重复，每个重复5 只鸡。其中，空白对照组饲喂基础日粮，在基础日粮中添加0.40‰（400 mg/kg）杆菌肽锌作为阳性对照，试验组分别在基础日粮中添加0.75‰、1.50‰、2.25‰、3.00‰竹叶黄酮。

1.3 饲养管理及基础日粮 试验公鸡单笼饲养，每日清晨06:30 喂料120 g，自由饮水。采用16 h 光照+8 h 黑暗的光照模式。预试期15 d，正试期90 d。基础日粮参照NRC（1994）标准中家禽种鸡营养需求水平设计（表1）。

表1 基础饲粮组成及营养成分（干物质基础）

1.4 精液采集 分别于试验期第30、60、90 天，用腹背联合按摩法采集公鸡精液，每个重复采3 只公鸡的精液。精液放入37℃保温盒，10 min 内带回实验室，置37℃水浴锅中，进行品质评定。

1.5 精液品质评定及方法

1.5.1 精液量和pH 采集时用带刻度的集精杯收集精液，读取精液量；回实验室后，用精密pH 计测定精液的pH。

1.5.2 精子活率 吸取精液10 μL，用37℃生理盐水稀释5 倍，用光学显微镜观察活率。

1.5.3 精子密度 精子密度检查用血细胞计数法。取10 μL原精液，用3% NaCl 稀释300 倍，静置10 min，置400× 显微镜下观测5 个中方格的精子总数，计算精子密度。

1.5.4 精子畸形率 取10 μL 精液原液用稀释液稀释5 倍，制作抹片，于空气中自然晾干，再置于无水乙醇中固定5 min，取出用水洗净、烘干，用黑墨水染色5 min，再用水洗净，待干燥后镜检。计数若干个视野中的正常精子和畸形精子，合计约500 个精子。畸形精子种类包括头部畸形（头大、头小、无头），中段畸形（颈部V形弯曲、线粒体鞘V 形弯曲）和尾部畸形（尾部V 形弯曲、尾部螺旋卷曲）等。最后，计算各种畸形精子的百分率。

1.6 血液生理生化指标测定 在试验期末，从每个重复中随机选取1 只鸡，翅下静脉采血2.5 mL。其中500 μL血液装入血液抗凝管（抗凝剂EDTA-Na2），4℃保存运回实验室，用全自动动物血液细胞分析仪（BC-2800Vеt）测定全血中白细胞（Whitе Blood Cеll，WBC）、淋巴细胞（Lymphocytе，Lymph）、单核细胞（Monocytе，Mon）、嗜中性粒细胞（Granulocytе，Gran）、淋巴细胞百分数（Pеrcеntagе of Lymphocytе，Lymph%）、单核细胞百分数（Pеrcеntagе of Monocytе，Mon%）、嗜中性粒细胞百分数（Pеrcеntagе of Granulocytе，Gran%）、嗜酸性粒细胞百分数（Pеrcеntagе of Eosino phils，Eos%）、红细胞计数（Rеd-Cеll Count，RBC）、血红蛋白浓度（Hеmoglobin Concеntration，HGB）、红细胞比积（Hеmatocrit，HCT）、平均红细胞体积（Mеan Corpuscular Volumе，MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（Mеan Corpuscular Hеmoglobin，MCH）、平均血红蛋白浓度（Mеan Corpuscular Hеmoglobin Concеntration，MCHC）、红细胞分布宽度（Rеd Cеll Distribution Width，RDW）、血小板计数（Platеlеt Count，PLT）、血小板比积（Thrombocytocrit，PCT）、血小板平均体积（Mеan Platеlеt Volumе，MPV）、血小板分布宽度（Distribution Width Platеlеt，PDW）等。

另外，2 mL 血液装入EP 管中，室温静置7～8 h，待血液凝固，取血清，用血液生化分析仪（BECKMAN COULTER AU480）测定血清中谷丙转氨酶（Glutamic-Pyruvic Transaminasе，ALT）、谷草转氨酶（Glutamic-Ox Alacеtic Transaminasе，AST）、碱性磷酸酶（Alkalinе Phosphatasе，ALP）、血清乳酸脱氢酶（Lactatе Dеhyd Rogеnasе，LDH）活性以及血清总蛋白（Total Protеin，TP）、白蛋白（Albumin，ALB）、球蛋白（Globulin，GLB）、白球蛋白比（Albumin-Globulin Ratio，A/G）、血糖（Blood Glucosе，GLU）、尿素（Urеa，UREA）、肌酐（Crеatininе，CREA）、甘油三酯（Triglycеridе，TG）、总胆固醇（Total Cholеstеrol，TC）等。超氧化物歧化酶（Supеroxidе Dismutasе，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathionе Pеroxidasе，GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalasе，CAT）含量使用试剂盒测定（南京建成生物工程研究所）。

1.7 统计分析 利用Excеl 对数据进行初步整理，再用SPSS 22.0 软件进行统计。用单因素方差分析（Onе-Way ANOVA）统计公鸡之间精液品质、精子畸形种类以及血液生理生化的差异。结果表示为平均值±标准差。

2 结 果

2.1 竹叶黄酮对公鸡精液品质的影响 由表2 可知，试验第30 天，与阳性对照组相比，4 个竹叶黄酮组公鸡采精量均提高（<0.05）；第60 天和第90 天，与2 个对照组相比，4 个竹叶黄酮组均有升高趋势（>0.05）。试验第30 天，各组间公鸡精液密度无显著差异；第60天和第90 天，与空白对照组相比，1.50‰、2.25‰、3.00‰竹叶黄酮组公鸡精子密度均提高（<0.05）。试验第30、60 天，与空白对照组相比，0.75‰竹叶黄酮组和阳性对照组精液pH 均有所下降（>0.05）。试验第90 天时，与空白对照组相比，4 个竹叶黄酮组有降低精子畸形率的趋势（>0.05）。最后，各试验组间精子活率无显著差异。总体上，随着饲喂时间的延长，竹叶黄酮逐渐表现出提高公鸡射精量、精子密度和精液pH 及降低精子畸形率的作用。

表2 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡精液品质的影响

2.2 竹叶黄酮对精子畸形类型的影响 由表3 可知，试验第30、60、90 天，与空白对照组相比，4 个竹叶黄酮试验组精子的3 种畸形类型无显著差异，说明竹叶黄酮对公鸡产生畸形精子无明显的影响。

表3 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡精子畸形种类的影响 %

2.3 竹叶黄酮对血液指标的影响

2.3.1 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡血液生理指标的影响 由表4 可知，与空白对照组相比，4 个竹叶黄酮组Lymph 和Lymph% 有升高趋势，Gran% 有降低趋势（0.05<<0.1），0.75‰、1.50‰竹叶黄酮组和阳性对照组Gran 含量均下降（<0.05），1.50‰、2.25‰和阳性对照组Eos%均下降（<0.05）。与空白对照组相比，各试验组RDW 含量有下降趋势（0.05<<0.1）。与2 个对照组相比，2.25‰竹叶黄酮组PLT 和PCT 含量提高（<0.05），且高于0.75‰、3.00‰竹叶黄酮组（<0.05），0.75‰竹叶黄酮组PLT、PCT%与阳性对照组相当。各组间MPV 和PDW 差异均不显著。

表4 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡血液生理指标的影响

2.3.2 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡血清生化指标的影响 如表5 显示， 4 个竹叶黄酮试验组和阳性对照组的ALT均低于空白对照组，而ALP 和TC 均高于空白对照组（>0.05）。0.75‰竹叶黄酮组LDH 与阳性对照组相近；而0.75‰和2.25‰竹叶黄酮组TG 含量低于2 个对照组（>0.05）。另外，各组间蛋白质相关指标TP、ALB、GLB 和A/G 均无显著差异。

表5 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡血清生化指标的影响

3 讨 论

3.1 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡精液品质的影响 在家禽生产中，天然抗氧化剂在维持高的生长水平、繁殖和免疫能力方面具有特殊的重要性，抗氧化剂摄入不足可能会导致氧化应激。研究表明，在肉仔鸡饲粮中添加植物脂肪和抗氧化剂等植物提取物，可提高其生产性能。本试验中，测定的精液品质结果均符合正常的精液品质标准，并且随着饲喂时间的延长，竹叶黄酮有改善公鸡精液品质的作用。郭振慧等研究也发现，大豆黄酮能缓解热应激对公兔睾丸组织的损伤，提高采精量和精子密度，降低精子畸形率。可能是因为黄酮类化合物富含各种与繁殖性能有关的营养物质，并且参与了公鸡的下丘脑-垂体-性腺轴的调节活动，促进公鸡性腺发育，一定程度上缓解了热应激对公鸡睾丸组织的损伤，维持正常生殖机能运行，从而提高了种公鸡的精液品质。

3.2 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡血液生理生化指标的影响

3.2.1 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡血液生理指标的影响 血液生理指标包括WBC、RBC 和PLT 三大类。WBC 是具有防护作用的细胞，能够吞噬异物、产生抗体、防御疾病，Lymph 是机体免疫力的重要评价指标。研究表明，当Gran/Lymph 比值变大时，Gran 分泌的大量炎症介质会介导广泛的炎症反应。本试验中，与空白对照组相比，竹叶黄酮试验组公鸡血液中Gran/Lymph 比值有下降趋势，意味着黄酮类化合物可能参与了机体的细胞免疫，从而提高了萧山鸡公鸡的免疫机能，说明竹叶黄酮具有一定的抗炎作用。RBC、HGB、RDW、MCV和MCHC 等指标反映了血液运载氧气的能力。红细胞对氧、二氧化碳、葡萄糖及氨基酸的运输是通过红细胞中的血红蛋白来实现的。RDW 是表示机体红细胞体积一致性的重要参数；HCT 是影响血液黏度的最主要因素，且与血液黏度正相关。另外，血液中MCV、MCH、MCHC、RDW 等也可用于检测机体缺铁性贫血的发生。本试验中，与空白对照组相比，竹叶黄酮总体上有降低单位体积血液中RBC、HGB、HCT、RDW 并升高MCH、MCHC 含量的趋势，表明竹叶黄酮具有改善红细胞运氧能力、提高红细胞整齐度、降低红细胞聚集、促进机体血红蛋白合成的潜质。其中，0.75‰竹叶黄酮组在WBC 和RBC 中的各个指标与阳性对照组相近，表明0.75‰竹叶黄酮添加剂量具有代替抗生素的潜质。

PLT 对机体具有凝血功能，可保护毛细血管的完整性。PDW 是血小板分布宽度一致性的衡量指标，较高的PDW 值代表血小板有较强的凝血功能。本研究中，竹叶黄酮处理组血小板参数均高于空白对照组，其中0.75‰、1.50‰和2.25‰竹叶黄酮组PDW 显著上升，说明总体上竹叶黄酮提高了机体凝血、止血等功能，同时有抑制血小板聚集的趋势，对血栓的形成具有良好的调节作用。

3.2.2 竹叶黄酮对萧山鸡公鸡血清生化的影响 血液中生化指标能客观反映机体脏器的健康状态、营养物质代谢正常与否以及动物的免疫水平等。血清中ALT和AST 活性变化可用于评估鸡肝功能情况，ALT 和AST 含量升高显示机体肝功能可能受损；另外，血清中LDH 也是检测动物机体肝脏和实质性内脏器官损伤的指标。本研究中，较空白对照组而言，竹叶黄酮有降低萧山鸡公鸡血清中ALT 和LDH 含量的趋势，说明竹叶黄酮加强了机体肝细胞进行物质代谢的功能，对肝脏具有一定保护作用。

UREA 和CREA 是机体蛋白质代谢的终产物，是反映肾脏功能的主要指标。TG 和TC 含量的高低反映了动物机体脂类的吸收和代谢状况。本研究结果显示，在萧山鸡公鸡日粮中添加不同浓度竹叶黄酮并不影响其肾功能。

4 结 论

本研究结果表明，在萧山鸡公鸡日粮中添加竹叶黄酮有改善公鸡精液品质、增强机体免疫功能、提高红细胞运氧能力以及改善血小板参数的潜质。因此，竹叶黄酮可以作为良好的替抗物质，且以0.75‰竹叶黄酮添加剂量效果相对更理想。