异常表达的PVT1作为诊断标志物预测重症肺炎合并呼吸衰竭患儿临床结局的研究

张敏，郑贵兰

(曹县人民医院 普儿科，山东 菏泽 274400)

肺炎(pneumonia)是指发生在肺泡、肺间质及终末气道的炎症反应，多由病原微生物、理化因素以及药物所致[1]。根据疾病的轻重程度，肺炎又分为轻症肺炎与重症肺炎[2]。前者症状轻微、预后良好；后者的病情往往是复杂多变，且常常伴随着呼吸衰竭，如治疗不当或不及时，则病死率极高，是感染性疾病中最常见的死亡原因之一[3]。儿童的免疫系统尚未发育完善，因而肺炎成为儿科疾病中常见的一种呼吸道疾病，并且一年四季均可发病。目前，临床上对儿童重症肺炎合并呼吸衰竭的治疗主要采用抗感染治疗和辅助通气治疗，但即便如此，仍有部分儿童因治疗不当或者漏诊而死亡[4]。因此，寻找有诊断价值的生物标志物对于疾病的诊断而言是极为有意义的。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录长度超过200个核苷酸的非编码序列[5]。近年来，随着DNA测序技术的不断发展，人们发现lncRNA在个体的生长发育、疾病的发生发展以及神经科学等领域发挥了重要作用。LncRNA已被证实参与疾病的调控，而某些lncRNA也被证实与肺炎有关[6]。Zhou等[7]的研究显示，lncRNA SNHG16通过与趋化因子CCL5竞争结合miR-146a-5p，进而介导JNK信号通路和NF-κB信号通路调控脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的WI-38细胞(人胚肺细胞)炎症损伤，为肺炎的诊断和治疗提供了新的思路。Chen等[8]的研究证实，lncRNA RP11-248E9.5和RP11-456D7.1对儿童肺炎有较高的诊断价值。LncRNA PVT1位于染色体8q24[9]，作为一种重要的致癌基因，PVT1已被证实在肺癌、肝癌、乳腺癌等实体癌症中异常表达[10-12]。研究[13]表明，PVT1在脓毒症大鼠的心肌组织中表达上调，并通过促进炎症因子的分泌加速抑制心功能。PVT1在LPS诱导的巨噬细胞炎症反应中表达增加，并与IL-1β的表达呈正相关，PVT1通过活化肺成纤维细胞促进肺纤维化[14]。基于以上研究，我们推测PVT1可能在肺炎中发挥一定的作用。因此，本研究试图通过实验验证PVT1在重症肺炎合并呼吸衰竭患儿血清中的表达情况，并进一步评估PVT1对该病的诊断及预后价值。

1 资料与方法

1.1 研究人群和样本采集

本研究共招募82例来本院就诊并确诊为重症肺炎合并呼吸衰竭的患儿(疾病组)。纳入标准：(1)满足美国儿科感染性疾病学会/美国感染性疾病学会(IDS/IDSA)重症肺炎诊断指南的临床诊断标准[15]；(2)满足呼吸疾病中呼吸衰竭的诊断标准；(3)呼吸衰竭仅由重症肺炎诱发所致，患儿可接受机械通气治疗。排除标准：(1)患有其他的器官或系统感染的患儿；(2)严重肝肾功能不全的患儿；(3)患有免疫系统疾病的患儿；(4)恶性肿瘤患儿。另选取来本院进行体检的健康儿童作为健康对照组。本研究遵循《赫尔辛基宣言》中关于人体研究的伦理原则，并已得到曹县人民医院伦理委员会的批准。本方案招募的所有受试儿童的监护人均已签署书面知情同意书。在获得知情同意后，对纳入到本研究的所有儿童进行一般临床资料的采集及汇总，包括性别、年龄、体质量指数等。采集所有受试者的外周静脉血于抗凝管中，检测白细胞计数、红细胞沉降率、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数等指标；血液离心后收集上层血清置于-80 ℃保存，备用。

1.2 RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT- PCR)

根据TRIzol(Invitrogen，美国)的说明书上的方法及步骤进行总RNA的提取，然后使用TaqMan microRNA反转录试剂盒(Invitrogen，美国)将RNA反转录成cDNA。使用miScript SYBR®Green PCR试剂盒(Qiagen GmbH，德国)和SYBR green I Master Mix 试剂盒(Invitrogen,USA)在qRT-PCR系统(Applied Biosystems，美国)上进行扩增，以GAPDH和U6作为内参并以2-ΔΔCt法对PVT1及miR-16-5p的相对表达量进行计算。

1.3 随访方案及内容

通过为期28 d随访调查记录在随访时间内患儿发生死亡事件的情况，并在随访结束后绘制患儿发生不良事件的生存曲线，评估PVT1的表达水平与预后之间的关系。

1.4 荧光素酶报告基因实验

使用StarBase V 2.0在线程序进行靶基因预测，发现miR-16-5p与人类PVT1基因转录本的3′-UTR区具有互补结合位点，随后通过双荧光素酶报告基因实验对此进行验证。首先，将PVT1的3′-UTR序列片段克隆到psiCHECK-2荧光素酶报告基因载体中，构建野生型(wild-type)报告载体PVT1-3′-UTR和突变型(mutant-type)报告载体PVT1-3′-UTR。将A549细胞以1×105个·孔-1的密度接种于24孔板中并培养过夜，直至每孔细胞密度达到60%以上。随后根据产品说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)分别将上述载体和miR-NC、inhibitor NC、miR-16-5p mimic或miR-16-5p inhibitor共转染细胞。转染48 h后收集细胞，采用双荧光素酶报告系统(Promega，美国)测定各组荧光素酶活性。海肾荧光素酶作为对照基因。

1.5 统计学处理

本研究采用SPSS 21.0(SPSS，美国)和GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software，美国)进行数据分析。符合正态分布的数据均以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，分类变量间比较采用卡方检验；ROC曲线评估PVT1、miR-16-5p在重症肺炎合并呼吸衰竭患儿中的诊断价值；Pearson相关系数分析连续变量之间的相关性；Kaplan-Meier曲线及Log-rank法检验PVT1对患儿不良预后的预测价值。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 人口及临床资料

受试者的一般资料及临床数据见表1。两组受试者在性别、年龄、体质量指数、白细胞计数等指标上差异无统计学意义(P>0.05)，而疾病组的中性粒细胞、C反应蛋白、乳酸脱氢酶、淋巴细胞及降钙素原水平均显著高于健康对照组(P<0.001)。

表1 两组间人口统计学和临床特征Tab 1 Demographic and clinical characteristics between two groups

2.2 疾病组血清PVT1、miR- 16- 5p的表达水平及二者相关性分析

采用qRT-PCR技术对疾病组与健康对照组受试者的血清PVT1和miR-16-5p水平进行检测，结果发现，与健康对照组相比较，疾病组患儿血清PVT1的水平显著升高(P<0.001，图1A)，而miR-16-5p的水平则明显降低(P<0.001，图1B)。疾病组与健康对照组的PVT1和miR-16-5p的差异表达说明在重症肺炎合并呼吸衰竭的过程中PVT1和miR-16-5p可能发挥了重要的调控作用。另外，Pearson相关分析证实，疾病组患儿血清miR-16-5p水平与PVT1水平呈显著负相关性(r=-0.734 3，P<0.000 1，图1C)。

2.3 PVT1与临床指标的相关性

本研究采用Pearson相关系数法评估PVT1与患儿各项临床病理特征的相关性。结果显示，PVT1的表达水平与患儿的中性粒细胞、C反应蛋白、淋巴细胞以及降钙素原的水平呈现显著的正相关性(P<0.05，表2)，表明PVT1的水平与患儿的疾病严重程度有关。

表2 PVT1与各项指标的相关性Tab 2 Correlation between PVT1 and various indicators

2.4 血清PVT1及miR- 16- 5p的诊断价值分析

在本研究中，我们采用ROC曲线评估了PVT1、miR-16-5p以及二者联合对疾病的诊断意义。结果见图2A～C，PVT1、miR-16-5p以及二者联合的ROC曲线具有相近并且较高的AUC值、敏感度和特异度，对疾病诊断具有较高的临床价值。以上结果表明单独PVT1和单独miR-16-5p均具有区分患儿和健康人群的能力，二者联合并未观察到诊断价值提高或者降低的现象。

A.两组血清PVT1的相对表达量(***P<0.001)；B.两组血清miR-16-5p的相对表达量(***P<0.001)；C.Pearson相关系数分析疾病组患儿血清PVT1与miR-16-5p的相关性图1 PVT1、miR-16-5p的表达水平及相关性分析A.Relative expression of PVT1 in serum of two groups(***P<0.001);B.Relative expression level of miR-16-5p in serum of two groups(***P<0.001);C.The correlation between the expression level of miR-185-5p and PVT1 in disease groupFig 1 Expression level and correlation analysis of PVT1 and miR-16-5p

2.5 PVT1对重症肺炎合并呼吸衰竭患儿不良预后的预测价值

本研究根据疾病组所有患儿血清PVT1的平均表达水平，将患儿分为PVT1高表达组(n=47)和PVT1低表达组(n=35)，并根据患儿在28 d随访期间内发生死亡事件的情况绘制Kaplan-Meier生存曲线，通过分析PVT1的表达与患儿发生死亡事件的关系，评估PVT1对儿童重症肺炎合并呼吸衰竭的预后价值。实验结果表明，PVT1高表达组患儿出现死亡事件的概率显著高于PVT1低表达组(Log-rankP=0.014，图3)。

A.LncRNA PVT1的ROC曲线；B.miR-16-5p的ROC曲线；C.LncRNA PVT1和miR-16-5p的ROC曲线图2 PVT1、miR-16-5p及二者联合对疾病的诊断价值分析A.ROC curve of LncRNA PVT1;B.ROC curve of miR-16-5p;C.ROC curve of LncRNA PVT1 plus miR-16-5pFig 2 Diagnostic value analysis of PVT1,miR-16-5p and their combination for disease

图3 不同PVT1表达水平的患儿Kaplan-Meier生存曲线分析Fig 3 Kaplan-Meier survival curve analysis of pediatric patients with different PVT1 expression levels

此外，我们通过多因素Cox回归分析验证了PVT1以及各项临床指标与预后之间的关系。结果如表3所示，PVT1(HR为3.274，95 %CI为1.173～9.143，P=0.024)、miR-16-5p(HR为0.142，95 %CI为0.178～0.955，P=0.039)均可作为重症肺炎合并呼吸衰竭的独立预测因子。

表3 多因素Cox分析临床特征与总生存率的关系Tab 3 Multivariate Cox analysis of the relationship between clinical features and overall survival rate

2.6 miR- 16- 5p直接靶向PVT1的3′- UTR区

线上数据库StarBase V 2.0预测PVT1与miR-16-5p的3′-UTR区域有结合位点，二者的互补序列见图4A。随后，采用荧光素酶报告基因对此结果进行分析，我们发现，转染miR-16-5p mimic后野生型PVT1-3′-UTR组的荧光素酶活性显著降低，而转染miR-16-5p inhibitor后显示野生型PVT1-3′-UTR组的荧光素酶活性明显增强(P<0.001，图4B)。另外，对于突变型PVT1-3′-UTR组而言，不管是转染miR-16-5p mimic还是转染miR-16-5p inhibitor均对荧光素酶活性无影响。以上结果表明，PVT1直接与miR-16-5p结合并负向调控其表达水平。

3 讨 论

世界卫生组织(WHO)的统计数据显示全世界每年近30%的新生儿死于重症肺炎，而受重症肺炎影响的儿童大约是1.56亿例[16]。肺炎的发病相对较为隐匿，常常缺乏较为典型的临床表现与体征，因而往往容易被误诊为上呼吸道感染，最终导致病情延误及恶化。重症肺炎是一种严重的肺部炎症，常常伴随着呼吸功能的衰竭，严重者将会影响循环系统，甚至危及生命安全[17]。目前而言，关于重症肺炎的发病机制尚不完全清楚，但已被确证的机制涉及免疫系统与炎症反应[18]。当前临床上对于重症肺炎的治疗主要集中在抗感染治疗、辅助恢复呼吸功能以及免疫支持治疗3个方面[19]。对于重症肺炎患儿而言，正确的诊断并进行积极的治疗可有效地改善不良预后。

有研究[20-21]表明，PVT1作为致癌基因在癌症患者的血液中表达升高，并且PVT1高表达患者的预后较差。另有研究[22]发现，PVT1在肺炎链球菌坏死性肺炎模型的组织中表达上调，而敲低PVT1后可抑制肺泡上皮细胞的凋亡及炎症因子的生成。Liu等[23]报道，PVT1是脓毒症患者发生急性呼吸窘迫综合征的独立危险因素。LncRNA通常作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA)，microRNA的“分子海绵”(miRNA sponge)而抑制miRNA的表达从而发挥基因调控作用。据报道[24]，过表达miR-16-5p在LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤中通过靶向CXCR3发挥对肺损伤的保护作用。Yin等[25]的研究发现，增强miR-16-5p的表达水平可抑制脓毒症诱发的肺损伤，表现为抑制小鼠模型的肺组织水肿、抑制炎症及细胞凋亡。本研究中我们发现，重症肺炎合并呼吸衰竭患儿血清PVT1水平显著升高，而miR-16-5p水平则明显降低。

A.miR-16-5p和PVT1的结合位点；B.转染miR-16-5p mimic显著抑制野生型PVT1 3′-UTR的荧光素酶活性，而miR-16-5p inhibitor则相反(***P<0.001)图4 PVT1与miR-16-5p的靶向关系的验证A.The binding sites of miR-16-5p and PVT1;B.Transfection of miR-16-5p mimic significantly inhibited the luciferase activity of WT-PVT1 3′-UTR,while transfection with miR-16-5p inhibitor showed the opposite result(***P<0.001)Fig 4 Verification of the targeting relationship between PVT1 and miR-16-5p

这与之前发表的相关研究结果具有一致性。Pearson相关系数分析miR-16-5p的表达与PVT1的水平呈负相关性，而患儿的部分临床病理指标则与PVT1水平呈正相关。这说明PVT1与miR-16-5p可能同时在重症肺炎合并呼吸衰竭中发挥作用，且PVT1水平与疾病严重程度有关联。

大量研究证实lncRNA和miRNA有作为疾病诊断和预后生物标志物的潜能。例如，Pan等[26]证实PVT1对早期结肠癌具有潜在的诊断价值，并且在癌组织中过表达PVT1预示着患者的预后较差。有研究[27]证实在社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)患者中，入院时高水平的miR-146a-5p和miR-16-5p与随访30 d时较低的死亡率相关，两种miRNAs都可作为CAP患者预后的生物标志物。本研究的ROC曲线分析结果显示出PVT1和miR-16-5p对重症肺炎合并呼吸衰竭患儿而言具有较高并且相似的诊断价值，同时，二者联合的ROC曲线并未显示出更优秀的诊断价值，我们因此推测单独的PVT1、miR-16-5p对疾病的诊断价值同二者联合的诊断价值是近似的。此外，本研究进行了为期28 d的随访调查，对患儿发生不良预后的情况进行分析，我们发现PVT1高表达患儿发生死亡事件的人数较多，同时多因素Cox回归分析表明PVT1在重症肺炎合并呼吸衰竭中是独立的预后因子。说明高表达PVT1的患儿具有较高的预后不良发生的概率。另外，我们通过荧光素酶报告基因实验初步验证了PVT1与miR-16-5p的直接靶向作用，这一结果与二者的相关性结果是一致的。尽管我们凭借实验手段证明了PVT1对于疾病的诊断和预后价值，也初步验证了PVT1与miR-16-5p的结合，但是二者在重症肺炎合并呼吸衰竭中的具体机制以及他们是如何对疾病进行调控仍然是未知的，我们仍需要在此结果的基础上进行深入的探讨。

综上所述，本研究证实在重症肺炎合并呼吸衰竭儿童的血清中PVT1的表达增加，而miR-16-5p的表达减少，并且miR-16-5p的水平随着PVT1水平的增加而降低。ROC曲线证明了PVT1作为生物标志物对疾病诊断的临床价值。另外，高表达的PVT1与患者的预后不良有关，且PVT1是重症肺炎合并呼吸衰竭的独立预后因子。因此，我们推测PVT1具有作为重症肺炎合并呼吸衰竭临床诊断和预后评估的潜在的生物标志物的能力。