溶血标本的CK-MB活性检测异常结果研究

倪军，顾寿永，汪彦阳，魏雪菲，周远洋，彭鲁，张葵，柏兵,,5

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院 检验科，江苏 南京 210008；2.江苏省老年病医院老年医学研究所，江苏 南京 210024；3.南京大学医学院附属鼓楼医院 核医学科，江苏 南京 210008；4.南京医科大学附属脑科医院 检验科，江苏 南京 210029；5.南京大学医学院附属鼓楼医院 精准医学中心，江苏 南京 210008)

肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isozyme MB,CK-MB)是临床上检测心肌梗死与心肌炎等心脏损伤的重要指标之一。肌酸激酶(creatine kinase,CK)是由脑型(B)与肌型(M)亚单位组成的蛋白二聚体，主要分布在骨骼肌、心肌、平滑肌与脑组织中。其中，在脑组织中主要是BB型，在骨骼肌中主要为MM型，而在心肌中则主要为MB型和MM型。心肌受到损伤时CK释放至血清，因其检测方便、报告较快、价格较低，临床上通常检测CK-MB与总CK的活性，并取两者的比值作为心肌来源CK的相对特异性指标，以判断心肌损伤情况以及急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者诊断和一体化溶栓模式治疗的临床效果[1]。

临床检测工作中我们经常发现有CK-MB活性比该标本中检测到的总CK活性还要高的现象，难以合理解释，给临床带来较大困惑，影响疾病的准确判断。实际上，该现象在其他较多临床实验室中常见，并有报道称该现象与巨CK-Ⅱ、恶性肿瘤、脑部疾病等有关[2-4]，但这与出现此类结果的临床患者的病情并不吻合。

本实验室发现该现象在溶血标本中更为常见，并有随溶血加重而更加明显的趋势。现对此进行初步研究和探讨，从而为CK-MB活性准确检测和正确判读，提供更多的实验与理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集

南京大学医学院附属鼓楼医院健康体检者的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血浆和血清标本。血常规、生化32项、肿瘤指标、胸部CT等所有检查结果均正常，乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、梅毒、人类免疫缺陷病毒检查结果均为阴性。

1.2 仪器

Beckman AU5400全自动生化仪、Vitros FS 5.1全自动干式生化仪(Ortho Clinical Diagnostics)、奥林巴斯5400全自动生化仪、AIA-900全自动免疫分析仪(Tosoh Corporation)、罗氏E411全自动免疫分析仪、JX-650超声波细胞破碎仪、Heraeus Megafuge 8R离心机(Thermo Fisher)、OLYMPUS CX31显微镜。

1.3 试剂

总CK活性检测(常规化学方法)试剂盒来自于四川迈克生物科技股份有限公司(四川迈克)与南京澳林生物科技有限公司(南京澳林)。总CK活性检测(干化学方法)试剂盒来自于Ortho Clinical Diagnostics。CK-MB活性常规化学与干化学检测试剂分别来自于四川迈克和Ortho Clinical Diagnostics。CK-MB蛋白水平检测(质量法)试剂盒来自于Roche公司(罗氏)和Tosoh Corporation。

1.4 方法

1.4.1 溶血标本配制 1 ml肝素抗凝全血标本离心取红细胞，生理盐水洗涤3次至澄清后加1 ml去离子水。因红细胞破裂释放会补充渗透压，导致不能全部裂解。因此，用micro-tip头进行超声(JX-650超声波细胞破碎仪，2号超声头，30%能量，超声5 s，连续3次)细胞破碎，并在显微镜下确认细胞全部破碎。混匀后，用相同个体来源的血清配制成0、0.1%、0.3%、1%、3%的溶血标本。所有检测值均按配制体积换算回实际血清浓度。

1.4.2 样本检测 首先利用Beckman AU5400全自动生化仪及四川迈克试剂，对标本分别检测总CK活性与CK-MB活性，再在Vitros FS 5.1全自动干式生化仪(Ortho Clinical Diagnostics)和奥林巴斯5400全自动生化仪上进行复测比较。用罗氏E411与AIA-900全自动免疫分析仪(Tosoh Corporation)检测CK-MB蛋白水平(质量法)。对各结果进行分析比较。

1.4.3 抗体抑制实验 将四川迈克CK-MB试剂中含有CK-M亚单位抗体的试剂A，用总CK试剂盒中的试剂A进行稀释(以避免盐分差异等实验干扰因素)，然后加入到溶血程度为1%的标本中再测定各标本的总CK活性，以观察CK-M亚单位抗体对红细胞中释放的CK成分的抑制作用。

1.4.4 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)与CK活性检测结果的回顾性分析 回顾过去我院全自动常规化学与干化学生化分析仪(Beckman AU5400与Vitros FS 5.1)上的临床生化检测数据(干化学：2019年11月至2020年4月，839例；湿化学：2020年1月至2020年4月，735例)，以LDH为溶血依据，分析CK-MB与CK的活性比例数据，并进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 溶血标本的CK和CK- MB活性检测结果

在同一个临床个体来源的0、0.1%、0.3%、1%及3%不同程度溶血的标本中总CK活性略有上升，但CK-MB活性升高更加明显。CK-MB活性与总CK活性的比值在无溶血时为0.21，但到1%溶血时开始出现了1.09的比例倒置现象，并持续升高至3%溶血时的1.89(图1A)。在另外9个临床个体的不同程度溶血标本中同样出现CK-MB活性增高，并且出现CK-MB/CK值升高并倒置的现象(图1B)。

图1 溶血标本中CK-MB和CK检测结果Fig 1 The activity of CK-MB and CK in serum samples with hemolysis

2.2 溶血标本的CK和CK- MB活性干化学方法复测结果

为进一步确定该现象，我们用其它检测方法对此进行了验证。首先利用同一个临床个体来源的不同程度溶血标本，用Vitros FS 5.1全自动干式生化仪(Ortho Clinical Diagnostics)及其试剂进行了CK和CK-MB活性复测。在结果中虽然总CK活性也同样升高，但CK-MB活性没有明显升高，更没有CK-MB/CK值倒置现象(图2A)。再用另外9个临床个体的红细胞与血清标本进行重复实验，同样没有比例异常增高及倒置的现象(图2B)。

图2 干化学方法检测溶血标本中CK-MB、总CK活性以及CK-MB/CK结果Fig 2 Detection of the activity of CK-MB,total CK and CK-MB/CK in hemolysis serum samples by dry chemical method

2.3 溶血标本的CK- MB蛋白水平检测结果

为了分析该现象的原因，我们利用质量法检测了CK-MB的蛋白水平，以明确其是否真性升高。我们对10个临床个体来源的1%溶血标本逐一进行检测，除CK-MB活性均比总CK活性还要高的比例倒置现象外，并未检出CK-MB蛋白水平明显增高(图3A)，用另外的质量法进行复查也未检出其升高现象(图3B)。

图3 1%程度溶血标本中的CK-MB蛋白水平检测结果Fig 3 CK-MB level in serum samples with 1% hemolysis

2.4 溶血标本的CK- MB活性异常分析

基于抗体抑制法的CK-MB活性测定原理，是通过抗体抑制CK-M亚单位的活性来检测剩余的CK-B亚单位活性，再通过计算得到CK-MB活性，并非通过直接检测得到。因为血液中的CK主要为CK-MM与CK-MB，抑制掉CK-M后主要剩下CK-MB上的B亚单位，只要将剩余B 亚单位活性乘以2就间接得到CK-MB的活性[5-6]。这是临床CK-MB活性检测的一般方法。

如果抗体不能有效抑制CK-M亚单位，那么剩余的CK-M活性就会被当成CK-B亚单位活性并乘以2，从而造成结果假性增高的现象。因此，我们检测了试剂盒中的抗体对CK-M亚单位抑制的有效性,结果发现，不同浓度的抗体均对1%溶血标本的总CK活性无抑制作用(图4)。

图4 CK-M亚单位抗体对溶血标本总CK活性的抑制情况Fig 4 The influence of CK-M subunit antibody on total CK activity in serum samples with hemolysis

2.5 回顾性数据分析

CK-MB/CK值升高现象可能由标本溶血所致。为进一步分析溶血可导致CK-MB/CK值升高的现象，以LDH作为提示溶血的指标，我们回顾分析了本实验室的临床生化检测数据，包含常规化学方法及干化学方法的检测结果。如果CK-MB/CK值升高是由溶血引起，那么这些标本中的LDH有较高的趋势。正如预期，受溶血影响的常规化学检测结果显示CK-MB/CK值升高的样本组的LDH检测结果显著较高，如活性比值高于0.6的样本组LDH水平要高于比值低于0.6的样本组。再以比值为0.7与0.8作为分界值，比值较高的样本组同样有LDH升高现象。然而，在受溶血影响不明显的干化学检测方法下，CK-MB/CK值在这些组间都没有LDH水平差异的现象。这些结果都验证了CK-MB/CK值异常升高可由溶血引起，并受具体的检测试剂与方法所影响。LDH提示溶血情况，升高时标本溶血的可能性较大。见图5。

经t检验，* 表示差异有统计学意义，N.S.表示差异无统计学意义图5 临床标本总CK活性、CK-MB活性及LDH数据回顾性分析Fig 5 The retrospective analysis of CK,CK-MB and LDH

3 讨 论

本研究发现CK与CK-MB的常规化学活性检测结果在溶血标本中升高，并且CK-MB升高更明显，导致两者活性比值异常升高，甚至比例倒置的现象。然而，该现象并不在干化学方法检测中出现，质量法检测提示CK-MB的蛋白水平也没有在溶血标本中有明显升高。通过抗体抑制实验基本分析出CK-MB与CK活性比值异常升高的原因，是由CK-M亚单位的抗体对红细胞来源的CK无有效抑制作用所致，导致未能被封闭的CK-M活性被当成CK-B活性计算，从而导致了CK-MB活性的假性升高。

实际上，CK确实可以在红细胞、白细胞、血小板中表达[7]。在某些罕见遗传性疾病中出现，如CKBE中，该疾病患者的红细胞中表达CK-B亚单位，并且活性比正常对照组高达800倍[8]。另外，在红细胞全蛋白组学研究报道中，正常红细胞的胞浆中就表达一定丰度的CK，主要为M型[9-11]。红细胞中的CK-B亚单位肯定不能被本实验中的CK-M亚单位抗体所有效结合与抑制，因此肯定会造成CK-MB活性结果假性升高。然而这种情况仅见于罕见病中，与该现象在溶血标本中的常见性不符。正常红细胞中的CK-MM很可能与肌肉与心肌来源的CK-MM在空间结构与蛋白修饰上有所不同，因此不能被试剂盒中的抗体有效抑制，这可能是本研究中溶血标本的CK活性检测结果不受CK-M抑制抗体影响的主要原因。

通过本研究我们基本明确了溶血对CK-MB与CK活性检测的影响，与文献报道[12]一致。因此，在碰到它们的可疑结果时应首先根据LDH、血清α-羟丁酸脱氢酶(alpha-hydroxybutyric dehydrogenase)等生化检测结果进行溶血情况判断，并尽可能根据我们的报道进行校正[13]。另外，我们发现试剂盒中CK-M抑制抗体不能有效抑制红细胞中的CK-M亚单位，是导致CK-MB活性检测结果异常升高的主要原因。这也提示目前临床实验室中所有基于CK-M抑制抗体的CK-MB活性检测，都要经过溶血干扰验证才能明确其结果的可靠性。同时，我们也建议在临床上碰到重要的相关病情时，如急性心梗，应当利用基于质量法的CK-MB蛋白水平检测进行复查或直接作为首选方法。