丹参酮ⅡA干预间充质干细胞对LPS诱导N9小胶质细胞激活的抑制作用

黄南渠，屠 琳，王启兵，吴竞婧，罗 勇，冯 飞

(遵义市第一人民医院，遵义医科大学第三附属医院，1.药物临床试验机构办公室；2.法医司法鉴定所；3.神经内科；贵州 遵义 563000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其特征是进行性认知功能障碍和行为障碍[1]。积极探索AD的发病机制和治疗方法具有极其重要的价值和意义。近年来，大量研究表明间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)在治疗AD方面具有巨大潜力。MSC治疗AD的可能机制有很多，主要与MSC对神经炎症的调节有关：炎症较弱时，MSC促进免疫反应；当炎症过强时，MSC会抑制免疫反应，并且MSC具有向受伤组织迁移的能力[2]。正是基于这些作用，MSC在抗AD神经炎症方面具有良好的应用前景。我们课题组前期研究还发现MSC能有效提高AD模型大鼠的学习记忆能力，显著减少神经元凋亡，减少神经炎症相关细胞因子白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)IL-6、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达[3]。然而，MSC的应用仍然面临着问题和挑战。

MSC在体外扩增后容易老化，其分化为特定成熟细胞和调节炎症的能力会根据环境而减弱[4-5]。为了解决这个问题，我们课题组最初采用从中药丹参中分离的生物活性成分丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TⅡA)进行MSC移植前干预。我们发现TⅡA可以增加MSC对神经炎症的抑制，具有更好的神经保护作用[3]。但具体机制尚不清楚，相关研究表明，髓样细胞触发受体-2(Triggering receptors expressed on myeloid cells-2,TREM2)在神经炎症中具有重要的负调控作用，TREM2修饰的MSC具有更好的神经保护作用[6]。因此，我们推测TⅡA-MSC对抗神经炎症的优势也可能是基于TREM2的调节，使用Transwell共培养系统和TREM2 siRNA来进一步探索TⅡA-MSC对神经炎症优越性的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 N9细胞购自北京中科质检生物技术有限公司。TⅡA(HPLC>99.37%)从MedChemExpress购买。LPS(L4391,Sigma)、RPMI 1640(61870036,Gibco)、间充质干细胞培养基(Mubmx-03011-440,cyagen)、DMEM(10566016,Gibco)、胰蛋白酶-EDTA(T1300,PBS1GB5000)、FBS(E600001-0500、BBI Life Sciences)、青霉素-链霉素液体(P1400、Solarbio)、OPTI-MEM®(31985-062、Gibco)、LipofectamineTM3000(L3000015、Invitrogen RNATM干扰载体)、TREM2和阴性对照siRNA载体(Generalbiol)、CD45 Percp (103129,Biolegend)、CD29 PE(102207,Biolegend)、NovoCyteTM流式细胞仪(NovoCyte 2060R,ACEA BIO)、自动酶标仪(WD-2102B，北京六一生物科技有限公司)、RIPA(C1053,Applygen technologies)、BCA蛋白检测试剂盒(CW0014S，Cwbiotech)、Marker(#26617，Thermo scientific)、脱脂奶粉(P1622,Applygen technologies)、Mouse monoclonal anti-GAPDH(1/2000,TA-08,Zsbio)、Rabbit anti TREM2 (1/1000,DF12529,Affinity)、Rabbit anti IL-1β(1/1000,bs-0812R,Bioss)、兔抗TNF-α(1/500,AF7014,Affinity)、山羊抗小鼠IgG H&L(1/2000,ZB-2305,Zsbio)、山羊抗兔 IgG H&L(1/2000,ZB-2301,Zsbio)。

1.2 方法

1.2.1 MSC的制备与鉴定 C57BL/6小鼠购自中国江西ZHBYBiotech [等级：无特定病原体，SCXK 2019-0004]，并在22～23 °C下饲养，12 h光/暗循环。颈椎脱臼处死小鼠，用75%乙醇浸泡5 min。在无菌条件下取出小鼠的胫骨和肱骨。解剖骨膜和肌肉组织，用含1%青霉素-链霉素的DPBS反复冲洗胫骨和肱骨。接下来，切开髓腔并用DMEM完全培养基彻底清洗。离心(1 200 r/min，5 min，4 °C)后弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在DMEM完全培养基中。将骨髓细胞均匀铺在平板上，在37 °C、5% CO2的培养箱中培养。本实验经遵义医科大学动物实验伦理委员会批准[NO:(2019)2-231]。

1.2.2 细胞培养及给药 N9细胞在含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM完全培养基中培养。当细胞达到80%～90%汇合时进行传代培养。我们按照细胞数量1∶1在带有Transwell过滤器的间接共培养系统中培养N9细胞和MSC。在本研究中，MSC接种到上室，N9细胞接种到下室。实验分为对照组、LPS(1 μg/mL)组、LPS+MSC(1 μg/mL LPS + MSC)组、LPS+TⅡA-MSC(1 μg/mL LPS + TⅡA-MSC)组、LPS+TⅡA-MSC+TREM2 siRNA(1 μg/mL LPS + TⅡA-MSC + TREM2 siRNA)组。使用1 μg/mL LPS干扰N9细胞24 h诱导炎症。使用10 μM TⅡA干扰MSC 48 h制备TⅡA-MSC(本研究使用TⅡA修饰的MSC，而不是TⅡA和MSC的混合物，因此TⅡA处理后TⅡA被丢弃，见图1)。并且MSC的TREM2基因(siRNA处理48 h后丢弃siRNA)被TREM2 siRNA沉默。

图1 TⅡA干预后MSC(TⅡA-MSC)的简要制备过程

1.2.3 Western blot N9细胞与裂解缓冲液在4°C下孵育30 min，通过在4°C下以12 000 r/min离心10 min去除不溶性物质。小心吸取上清液以获得总蛋白。根据BCA试剂盒测定蛋白质浓度。各样品取等量十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)分离2 h，300 mA恒流转膜80 min。将印迹用TBST中的脱脂牛奶溶液在室温下封闭1 h。印迹用TBST洗涤3次，并与一抗在4°C下孵育过夜。印迹用TBST洗涤3次，每次5分钟，然后与相应的二抗溶液在室温下孵育2 h。然后，PVDF膜用TBST洗涤3次，并使用ECL曝光溶液进行观察。用Quantity One软件4.6.1版软件分析各抗体条带的灰度值。

2 结果

2.1 外泌体的改变 TⅡA-MSC与MSC相比，TⅡA-MSC的Exo含量显著比MSC高(P=0.038)，且TⅡA-MSC的Exo粒径更大(见图2)。

2.2 IL-1β,IL-6和TNF-α的变化 结果如图3所示。与对照组相比，LPS显着增加了N9细胞IL-1β(P=0.001)、IL-6(P=0.014)和TNF-α(P=0.001)的蛋白表达水平，表明LPS确实刺激了N9细胞的炎症反应；与LPS组相比，LPS+MSC组IL-6(P=0.014)和TNF-α(P=0.044)表达下调；LPS+TⅡA-MSC组IL-1β(P=0.002)、IL-6(P<0.001)和TNF-α(P=0.003)表达下调，而TⅡA-MSC对炎症因子的下调作用更显著。与LPS+MSC组相比，LPS+TⅡA-MSC组IL-6显著降低(P<0.001)。而使用TREM2 siRNA沉默MSC的TREM2基因后，TⅡA-MSC降低N9细胞炎症因子的能力减弱，与LPS+TⅡA-MSC组相比，TREM2 siRNA可显着减弱IL-6(P=0.005)和TNF-α(P=0.033)的降低，但这种作用在IL-1β(P=0.884)表达的调节上无显著差异。

A: Exo电镜代表性图片(1 μm)；B: Exo粒径分布。图2 TⅡA-MSC与MSC分泌的Exo比较

A: 代表性条带；B: IL-6；C: IL-1β；D: TNF-α；a：与对照组相比，P <0.05；b：与LPS组相比，P <0.05；c：与LPS+MSC组相比,P<0.05；d：与LPS+TⅡA-MSC组相比，P 图3 主要炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白的表达

3 讨论

中医药是中华民族数千年积累的智慧结晶。随着对中医药研究的不断深入，许多潜在的疗效与功能被进一步挖掘。研究发现，部分中药能够促进MSC增殖和分化，在治疗中产生中西结合的协同效应[7]。丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)，始载于《神农本草经》，被列为上品，味苦、性微寒，归心、肝二经。具有活血祛瘀、通经止痛、凉血消痈、清心除烦等功效；现代研究表明丹参及其有效成分具有广泛的生物活性和药理作用[8]。自20世纪80年代初丹参被引入贵州后被大面积推广种植，2015年纳入《贵州省中医药发展战略规划(2016-2030年)》。现贵州省丹参年产量超2000吨，已成为全国丹参的主要产区之一[9]。

TⅡA是丹参主要的特征性和活性成分。课题组前期研究发现，TⅡA预处理可改善氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)的大鼠海马神经元损伤[10]，OGD类似于MSC体外扩增和移植过程中的环境改变刺激。因此，结合丹参活血生血，精血互生的中医药理论，课题组选择TⅡA预处理MSC，发现预处理后的MSC具有更强的神经炎症抑制作用[3](已获得发明专利：CN201810094528.8)。因此研究TⅡA预处理MSC后更好抗炎作用的原因是一个值得探讨的科学问题。

MSC起作用的方式主要通过直接的介导作用和间接的释放可溶性因子[11]，而这些可溶性因子被两种不同直径的囊泡结构所包裹，其中具有更小直径的外泌体(Exosome,Exo)是一种直径约为30～120 nm的膜囊泡，含有来自其亲代细胞的蛋白质、脂质和miRNA[12]。研究表明，Exo在促进细胞表型转化中具有重要作用，Exo引导的细胞重编程技术能将M1表型巨噬细胞直接转化为M2表型巨噬细胞以进行有效的表型转化控制，从而调节促炎症与抗炎症之间的平衡，发挥保护作用[13]。源自MSC的外泌体(MSC-Exo)在各种自身免疫相关疾病中发挥免疫调节作用[14]，并且可以减轻组织损伤并促进组织修复[15]，这与其调节小胶质细胞(Microglia,MG)表型转化，使抗炎作用的M2型MG增加，减少促炎作用的M1型MG有关[16-17]。并且MSC-Exo中携带的miRNA(miR-223等)，可调控MG表型转化的关键蛋白TREM2从而发挥抗AD作用[18-19]。因此，根据相关研究和本实验发现的Exo结果表明，这种Exo的差别是TⅡA-MSC与MSC存在的重要区别之一。

而TREM2是高表达于MG上的一类免疫球蛋白样受体，不仅在炎症过程中发挥“负性调节”作用[6]，还在调控MG表型M1向M2转化中发挥关键作用[20]。TREM2过表达可通过降低iNOS及促炎细胞因子从而显著抑制M1，同时还通过增加精氨酸酶1(Arginase-1，Arg-1)和抗炎细胞因子的表达水平来增强M2极化[20]。上调TREM2的表达后，凋亡的神经元数目减少，部分抑炎因子表达升高；而下调TREM2表达后，凋亡的神经元数目增多，促炎因子表达升高[21]。因此，MSC-Exo调控的TREM2信号通路在介导MG表型由M1向M2转化中发挥关键作用。

本研究发现TⅡA干预后的MSC(TⅡA-MSC)的Exo含量高于MSC，TREM2 siRNA可减弱TⅡA-MSC对神经炎症的抑制作用。表明TⅡA干预后效果更佳的初步机制与促进Exo分泌，调控TREM2有关，但具体机制仍有不明确的地方。因此课题组将进一步探索TⅡA-MSC抗AD神经炎症的优效性原因及作用机制。这将为TⅡA应用于MSC的前处理提供实验依据，也为应用中西医结合技术开发MSC治疗AD提供新思路。