内质网应激-凋亡途径在肾缺血再灌注损伤中的研究进展

徐 鸿，梁国标

(遵义医科大学附属医院 泌尿外科，贵州 遵义 563099)

缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury，IRI)是指缺血的器官或组织重新获得血液灌注或供氧后，对器官或组织所产生的一系列损伤作用。肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)的一个常见原因，其致病机制复杂，涉及内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)、活性氧聚集、凋亡、炎症等一系列病理生理过程，而AKI又是肾功能衰竭的主要原因[1]。RIRI是临床上常见且复杂的病理生理过程，目前针对RIRI的具体机制研究尚不清楚。RIRI多见于肾移植术、创伤性休克、体外冲击波碎石、肾部分切除术以及心肺分流术等，是泌尿外科手术中及术后较常发生的并发症，严重影响手术预后。因此，在当前的临床工作中，采取怎样的措施去预防和减轻RIRI，从而促进肾功能的快速恢复成为目前所有泌尿外科医生亟待解决的关键问题。据相关研究报道，ERS参与了RIRI的发生与发展，并在这一过程中扮演了重要的角色，RIRI发生后会导致肾小管上皮细胞凋亡从而加重AKI，而ERS又是引起肾小管上皮细胞凋亡的主要原因之一[2]。因此，针对内质网应激-凋亡途径的靶向干预治疗极有可能成为临床上预防RIRI新的治疗方法。本文就以内质网应激-凋亡途径的相关机制与RIRI之间的研究进展作一综述报告，目的是为RIRI发病机制提供新思路，以及为RIRI防治寻找新的潜在干预靶点。

1 内质网与ERS

内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是一种存在于细胞内的多用途细胞器，它主要负责维持细胞功能的动态平衡和参与蛋白的合成与折叠。当内环境发生改变时，如钙离子稳态的破坏、缺氧、氧化应激等都可以造成ER内环境稳态的失衡，从而引起细胞内的错误折叠蛋白或者未发生折叠的蛋白异常增多，诱发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)。

1.1 未折叠蛋白应答(Unfold protein response，UPR) 在ERS状态下，未折叠蛋白在ER蓄积，是细胞自适应的结果，又称为UPR[3]。据相关文献报道，表达量持续增加的UPR则会引发细胞、组织损伤甚至器官功能障碍[4]。UPR在ERS中发挥的功能主要有：①当ER受到外界刺激产生ERS时，通过抑制未折叠蛋白的聚集，促进翻译正确蛋白的折叠而调节ER处于动态平衡状态；②当细胞一直发生应激时，就会触发细胞凋亡途径使未折叠蛋白大量聚集进而发生细胞凋亡[5-6]。在ER细胞膜上存在3个重要的跨膜蛋白，它们都参与了UPR过程，分别是内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(Inositol-requring protein-1α,IRE1α)、RNA依赖的激酶样内质网激酶(Protein kinase RNA(PKR)-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、激活转录因子6(Activating trascription factor 6,ATF6)[7-8]。图1 显示了ERS与凋亡通路的作用机制，该图引自参考文献[8]。

图1 ERS与凋亡通路的作用机制

1.2 葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78,GRP78) GRP78是热休克蛋白70(Heat shock protein 70，HSP70)家族的成员，存在于所有真核生物的ER膜上，当ER处于应激状态时，它的表达会增加[9]。GRP78主要通过两个结构域来调节UPR的功能，其中1个结构域是核苷酸结合结构域(NBD)而另1个是底物结合结构域(SBD)[10]。ER在静息状态下，3种跨膜蛋白的感受器均与GRP78/免疫球蛋白结合蛋白(BIP)结合形成复合物且处于无活性状态。当细胞受到来自外界刺激时，在ER的囊腔中未折叠蛋白和错误蛋白不断增多并产生聚集时，ER上的蛋白感受器与BIP发生脱离，并和未折叠蛋白相结合，同时激活产生PERK/真核细胞翻译起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)、IRE1α/ X-box结合蛋白1(X-box-binding protein 1，XBP1)、ATF6/ERSE 3条信号通路，促进蛋白质的折叠、成熟、分泌及ER相关降解基因的转录，以维持ER稳态促进细胞存活。在这个过程中，表达量增加的GRP78常被视为UPR发生的标志蛋白[11]。研究显示，在人类细胞中，当GRP78被敲除时，葡萄糖调节蛋白94(GRP94)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和XBP1的蛋白表达量会增加，UPR传感器被激活进而诱导细胞凋亡，这一结果表明GRP78具有抗凋亡作用，对细胞的存活至关重要[12]。GRP78除了通过由RIRI诱发ERS引起的细胞凋亡外，在许多癌细胞的增殖、侵袭和转移中也起着关键作用，如肾细胞癌[13]和前列腺癌[14]等。

2 ERS与细胞凋亡

ERS是细胞受到外界有害刺激时所产生的一种自身保护性应激反应，一定程度上的ERS可以通过调节UPR来保护ERS所引起的细胞损伤，进而稳定ER的功能[15]。但是，当ERS反应过强或持续存在超过ER所承受的范围时，UPR未能及时水解未折叠或错误折叠的蛋白，从而导致ER的稳态遭到破坏，此时UPR就会触发下游的凋亡信号分子，导致细胞凋亡。ERS所介导的细胞凋亡不仅存在于全身各大重要脏器IRI后，而且在其他疾病中也发挥了重要的作用。

2.1 ERS参与其他器官IRI介导的细胞凋亡 据报道，ERS参与了包括心、肝、脑、肠道、下肢、脊髓等重要脏器及组织IRI中细胞凋亡的发生与发展。研究发现，在右美托咪定预处理的大鼠心肌IRI模型中，右美托咪定可以抑制过度的ERS及其所介导的PERK/CHOP凋亡通路减轻因心肌细胞凋亡而引起的心肌损害[16]。在小鼠脑IRI模型中，应用JNK靶向抑制剂可以抑制凋亡相关凋亡信号调节激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)/JNK信号通路，从而为脑神经元提供保护作用[17]。在Wang[18]等所建立的大鼠脑IRI模型中，使用药物Sappanone A (SA)可以下调ERS中GRP78和凋亡蛋白CHOP 的表达，改善脑细胞凋亡。同样在大鼠肝脏IRI模型中，使用药物d-Pinitol预处理肝脏可以有效保护肝脏IRI所引起的肝损伤，并且这一过程是通过抑制 PERK/CHOP信号通路和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在肝IRI期间诱导的肝细胞凋亡所发挥作用的[19]。ERS除了参与重要脏器IRI后细胞凋亡发生外，还有参与了肠道、脊髓和下肢IRI。根据Lai的报道，在建立大鼠肠道IRI模型中，再灌注的早期即可以观察肠道IRI所诱发的AKI并激活了ERS的发生，高迁移率族蛋白-1能够抑制或中和ERS所引起的细胞凋亡进而减轻因肠道IRI引起的肾损伤[20]。脊髓IRI的早期阶段移植新鲜分离的线粒体可以抑制受损脊髓ERS，从而减少神经细胞凋亡并改善脊髓缺血大鼠的运动功能[21]。还有报道显示，在小鼠后肢IRI模型中，予再灌注过程中吸入氢气(H2)，结果发现H2能通过抑制ERS中IRE1α/JNK通路来减轻骨骼肌细胞凋亡进而减轻骨骼肌的损伤[22]。

2.2 ERS参与其他系统疾病的细胞凋亡 ERS已被证实在泌尿系肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、女性生殖系统及乳腺肿瘤等疾病发生中起着关键作用，使用药物可以直接和间接诱导ERS促进肿瘤细胞凋亡。有研究显示，百里醌作为黑籽油中分离出来的主要活性化合物，对膀胱癌细胞具有细胞毒性，通过激活ERS上调了磷酸化的eIF2α、IRE1α和CHOP蛋白的表达进而诱导了膀胱癌细胞的凋亡[23]。过表达的LncRNA MEG3通过miR-103a-3p/PDHB ceRNA 途径阻碍了结直肠癌细胞(SW620 和 HCT116)的增殖并诱导ERS上调了GRP78、ATF6和CHOP等蛋白的表达促进了结直肠癌细胞的凋亡[24]。亚硒酸钠作为抗肿瘤活性药物，通过激活ERS上调了ATF6、p-eIF2α、ATF4和 CHOP蛋白的表达促进了乳腺癌MCF7细胞的凋亡[25]。盐霉素可以通过抑制 Nrf2 信号通路诱导ERS促进前列腺癌细胞( DU145 和 PC-3)的细胞凋亡[26]。ERS除了参与肿瘤细胞的凋亡外，还参与了其他多种疾病的发生发展。例如，转化生长因子-β1是一种对心脏成纤维细胞具有显着促纤维化作用的细胞因子，使用转化生长因子-β1预处理的心肌细胞可以部分阻止因心肌IRI诱发的心肌细胞ERS相关蛋白CHOP的表达进而降低心脏成纤维细胞的凋亡[27]。还有在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，使用组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶(EHMT2)抑制剂 BIX-01294 激活了ERS中ATF4/CHOP通路进而诱导了淋巴瘤细胞的凋亡[28]。

综上所述，ERS与细胞凋亡关系密切并发生在全身各个重要脏器的IRI及其他疾病中，针对ERS的诱发及靶向抑制，可能是促进及预防因ERS所导致的细胞凋亡很好的干预措施。

3 RIRI的病理机制

尽管目前对RIRI的致病机制已经有广泛研究，但其具体机制仍不明确，已知的氧化应激反应、钙超载、铁死亡、细胞凋亡、炎症反应及坏死性凋亡等是目前RIRI研究的主要发生机制[29-31]。在众多发病机制中，氧自由基大量聚集所致的氧化应激反应是研究最早的也是研究最深入的，RIRI后在血液中会产生的大量氧自由基和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)促进肾小管上皮细胞凋亡并加重了肾损伤，研究发现大量肾小管上皮细胞凋亡是RIRI后肾功能损害加重的重要原因之一，早期使用高压氧这一治疗措施可以明显减少因RIRI所产生的氧自由基和TNF-α进而抑制肾组织细胞凋亡[32]。炎症反应参与RIRI的整个过程，主要是通过释放炎症因子TNF-α、核因子κB(NF-κB)和白介素-6(IL-6)损害组织和细胞进而引起肾功能损害，奥曲肽作为抗炎症反应的药物通过在小鼠RIRI模型中使用，研究发现奥曲肽能够减弱小鼠RIRI模型中炎症反应保护肾功能[33]。当发生RIRI时，细胞膜上的Ca2+通道开放导致细胞外大量Ca2+进入细胞内引起线粒体结构改变进而导致了能量代谢障碍加重了肾损害。在Hou等[34]人的研究中发现，瞬时受体电位通道 6 (TRPC6) 作为一种非选择性Ca2+通道，在小鼠RIRI模型中表达量增加而敲除该蛋白后减轻了肾小管损伤及肾功能损害。除了上述研究较多的病理机制外，最近针对RIRI也发现了一些新的研究方向。铁死亡作为新的细胞程序性死亡方式，在RIRI中起着重要的调节作用。研究发现，在小鼠RIRI模型中给予铁抑制素，再灌注24 h后观察小鼠肾组织损伤、血清肌酐和尿素均下降，因此，调节铁稳态和抑制铁死亡可能为RIRI提供一种新的治疗策略[30]。坏死性凋亡作为程序性细胞死亡的另一种可控方式，坏死性凋亡可以调节细胞坏死的整个过程并且已经证实了在RIRI中发挥了重要作用，其具体机制主要通过调控坏死性凋亡靶向信号分子受体相互作用蛋白激酶(Receptor interacting protein kinase,1 RIP1)和RIP-3启动坏死性凋亡的发生与发展，而早期使用高压氧治疗可以减少大鼠肾移植后缺血再灌注肾组织中RIP-1和RIP-3的蛋白表达量，降低了坏死性凋亡的发生可能性，达到保护肾脏的作用[35]。因此，针对上述机制的深入研究，不仅可以加深人们对RIRI发生、发展的认识，并且对于临床上预防及治疗RIRI也具有重要指导意义。

4 内质网应激-凋亡途径对RIRI的影响和作用机制

近年来有研究报道，RIRI后启动了内质网应激-凋亡途径，通过蛋白印迹和免疫荧光实时定量聚合酶链式反应实验结果显示ERS中GRP78、CHOP蛋白以及凋亡相关蛋白caspase12表达量明显上调，说明RIRI后激活了内质网应激-凋亡途径引起了肾小管上皮细胞的凋亡，进一步加重了RIRI[36]。探究内质网应激-凋亡途径在RIRI中的具体机制是目前研究的热点问题(见图2)。研究表明，针对内质网应激-凋亡途径的各种预处理和靶向抑制措施作用于ERS的不同通路可以抑制肾小管上皮细胞的坏死和凋亡进而保护肾功能。

图2 RIRI与内质网应激-凋亡途径的关系

4.1 内质网应激凋亡信号通路IRE1α与RIRI的关系 IRE1属于ER上的I型跨膜蛋白，主要存在ER膜上，具有核糖核酸酶和蛋白激酶活性，IRE1在哺乳动物中有两种结构：IRE1α(功能全面，表达广泛)和IRE1β(主要在肺、肠道黏膜上皮细胞表达，功能局限)。IRE1α在ERS中起着核糖核酸内切酶和跨膜激酶的双重作用进而参加mRNA剪接并传递UPR信号。IRE1α通路是ERS 3个主要通路之一，也是UPR三条通路中较为传统的一条信号通路，在ERS中起着非常重要的作用[37]。当发生ERS时，上述蛋白主要通过以下路径发挥作用：①通过激活ASK1和JNK蛋白，最终活化Caspase-12导致细胞出现坏死性凋亡[38]；②启动受调控的IRE1依赖性衰减(Regulated IRE1-dependent decay，RIDD) 过程，重新剪接存在于ER周围的mRNA，减少蛋白质翻译与合成缓解ER压力，导致细胞凋亡的发生[39]；③通过获得剪接的mRNA来活化XBP1，抑制蛋白质的合成与翻译，磷酸化CHOP，触发细胞凋亡途径和诱导ER分子伴侣的表达，促进蛋白质正确的折叠，稳定ER促细胞生存[40]。

根据Wang等[41]报道，在大鼠RIRI模型中，使用JNK靶向抑制剂Rutaecarpine(Ru)于大鼠肾脏再灌注前行腹腔注射，结果表明Ru不仅降低了肌酐、尿素氮、炎性细胞因子的含量，而且还可以减少RIRI诱导的肾小管上皮细胞凋亡进而保护肾组织，进一步证实了通过使用IRE1α通路靶向抑制剂能有效的降低肾小管上皮细胞凋亡引起的肾损伤。同时，在体内和体外实验中，Tian等[42]发现不管是在小鼠IRI模型还是在体外培养的肾小管上皮细胞模型中，ASK1靶向抑制剂SHP-1可以通过与ASK1结合并使其去磷酸化以抑制其活化并进一步阻断下游信号分子的激活从而抑制肾小管上皮细胞凋亡以达到保护肾组织的作用。还有实验发现，通过缺血40min/再灌注24h肾组织建立的IRI模型诱发了ERS，免疫荧光实时定量聚合酶链式反应和蛋白印迹实验结果显示GRP78、p-IRE1、XBP1s、CHOP和caspase-3蛋白表达上调，而在再灌注前使用IRE1α靶向抑制剂STF-083010可以下调上述蛋白的表达降低肾小管上皮细胞凋亡进而保护了肾组织[43]。因此，抑制IRE1α通路可以减轻因RIRI导致的肾小管上皮细胞坏死及凋亡，从而降低AKI的发生发展。

4.2 内质网应激凋亡信号通路PERK与RIRI的关系 PERK是位于ER上的Ⅰ型跨细胞膜蛋白，其结构域与IRE1α相似，表达丝氨酸-苏氨酸蛋白质激酶活性，是eIF2α上游激酶族谱中的关键蛋白，并且PERK信号通路也是UPR应对ERS过程中比较重要的一条通路[44]。当UPR持续存在并发生ERS时，PERK信号通路在初期首先被触发，是ERS时最主要的保护通路之一[45]。在静息状态下，PERK跨膜感受器与GRP78/ BIP相结合失去活性，当细胞受到外界刺激产生ERS时，PERK与BIP分离后PERK信号通路被激活。活化的PERK 能够使eIF2α发生磷酸化，一方面能够终止蛋白质的合成，缓解ER的负荷，另一方面能够上调调转录因子4(Transcription factor 4,ATF4)的表达，进而激活ERS细胞凋亡途径，有趣的是ATF4又是CHOP的上游调控因子，所以PERK-eIF2α-ATF4凋亡通路在ERS中扮演了重要的角色，另一方面活化的CHOP也可以激活Caspase-12蛋白而引起Caspase介导的细胞凋亡[46]。PERK通路依赖下游凋亡蛋白CHOP发挥作用，而IRE1α和ATF6也可以直接作用于CHOP发挥细胞凋亡的作用，所以针对CHOP的靶向抑制，不仅降低了细胞凋亡率，而且也阻碍了疾病的进一步发展。

例如，在小鼠RIRI模型中，使用右美托咪定干预组中ERS水平降低表现在ATF6、CHOP和Caspase-12蛋白表达量降低，而在IR组中上述蛋白表达量升高，并且细胞凋亡实验显示肾小管上皮细胞凋亡减轻，达到了保护肾组织的作用[47]。据Dong等[48]报道，在右肾切除下夹闭左肾动脉25 min/再灌注6h和24h建立的小鼠RIRI模型中，通过靶向敲除CHOP基因观察到可以改善缺血后微循环的恢复并且降低了肾小管上皮细胞的凋亡，保护了因RIRI所致的肾功能损害[49]。同样，在使用野生型小鼠和靶向敲除CHOP基因的小鼠建立的RIRI模型中，观察到IRI引起了野生型小鼠肾小管上皮细胞的凋亡，然而在CHOP基因敲除小鼠中肾小管上皮细胞损伤较野生型小鼠减轻[49]。在Liu等[50]证实，使用Brd4抑制剂 JQ1能够有效的降低因小鼠RIRI所诱导的ERS中GRP78 和 CHOP的表达进而减轻细胞凋亡。CHBP 作为促红细胞生成素(EPO)的有效稳定衍生物，在小鼠RIRI模型中能够有效的抑制ERS中CHOP蛋白的表达减轻细胞凋亡保护肾功能[51]。同样在大鼠RIRI模型中，使用丙泊酚预处理组的大鼠和IRI组大鼠相比较，肾功能(肌酐、尿素氮)、ERS中CHOP和Caspase-12及肾小管上皮细胞凋亡率都显著下降，改善了因RIRI诱导的细胞凋亡[52]。因此，抑制PERK通路不仅可以减轻因RIRI导致的肾小管上皮细胞凋亡，而且降低了AKI的发生可能性达到保护肾功能的作用。

4.3 内质网应激凋亡信号通路ATF6与RIRI的关系 ATF6是位于ER膜上II型跨细胞膜蛋白并且是ERS中的关键调控因子，同时属于亮氨酸拉链蛋白家族的转录因子，在ER中激活并被输送到高尔基体，在高尔基体被蛋白酶水解，释放出ATF6胞质N末端部分，其N端具有转录作用，而C端具有感应ERS的作用[53]。当ERS未激活凋亡通路时，ATF6常常以酶原(ATF6 p90)形式存在。当细胞受到外界刺激发生ERS时，ATF6 p90在高尔基体中被相关位点蛋白酶水解后生成促凋亡因子(ATF6 p50)，该因子重新被输入到细胞核内，上调了凋亡蛋白CHOP的表达，激活了凋亡通路，使Bc1-2表达下调进而抑制了细胞的抗凋亡能力，最终导致细胞发生凋亡[54]。例如，将大鼠肾脏缺血1h/再灌注2h建立RIRI模型，药物组在建模前使用二甲双胍腹腔注射，蛋白印迹实验结果显示GRP78、ATF6-α和CHOP相较于假手术组蛋白表达量增高，但是相较于IR组明显明显降低，这一结果表明二甲双胍可以作为很好的干预药物缓解RIRI后ERS引起的细胞[55]。

总之，在众多RIRI实验模型中，通过预处理ERS凋亡通路或基因靶向敲除通路关键蛋白，降低了肾小管上皮细胞的凋亡率，保护了肾功能(见表1)。这一理论成果已被大量实验结果所证实，但其具体分子机制仍需进一步的深入研究。弄清ERS在RIRI中的具体作用机制，将更好地为RIRI的治疗提供理论依据。

表1 ERS凋亡通路干预措施与RIRI的关系

5 展望

近年来，随着人们对ERS机制研究的深入，发现ERS与RIRI关系密切，RIRI的发生可以引起内质网应激-凋亡途径的激活。内质网应激-凋亡途径在RIRI中扮演着重要的角色。根据现有研究显示，ERS所引发的细胞凋亡会增加AKI对肾小球及肾小管的损害。但是，基于目前的研究，对ERS在RIRI中具体作用及发生机制的探究尚不明确。因此，临床上怎样有效调节内质网应激-凋亡途径中关键蛋白的表达，改善ERS状态从而保护肾功能，将为肾移植、肾脏肿瘤、肾部分切除术等术中及术后引起的RIRI的防治提供潜在的靶向治疗方向。