TFRs占Tregs的比例与HIV感染疾病进展的相关性分析

邓明惠，侯 轩，王 辉，段发强

艾滋病是由HIV感染导致的重大传染性疾病。自1981年发现HIV以来，经过40年的研究，人们对艾滋病的了解越来越深入。研究发现HIV感染过程中会导致机体过度免疫活化，机体免疫活化水平与疾病的进展密切相关[1]，与HIV RNA呈正相关，与CD4+T细胞计数呈负相关[2]。在HIV感染过程中，与典型进展人群相比，长期不进展人群（HIV感染10年以上，未经过抗病毒治疗，CD4+T细胞计数保持500个/μl以上，HIV RNA处于低水平）的免疫活化水平明显较低[3]。

调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）是CD4+T细胞的一个亚群，具有抑制免疫活化及免疫反应的作用[4]。在一般非艾滋感染性疾病及肿瘤中，Tregs通过抑制免疫活化与免疫反应对机体发挥不利的作用。但在HIV感染中，Tregs对机体发挥双重作用，是一把“双刃剑”：一方面通过抑制免疫活化对机体发挥有利的作用；另一方面通过抑制免疫反应对机体发挥不利的作用[5]。Tregs与HIV感染疾病进展的关系表明，Tregs计数与疾病进展呈负相关，即与HIV RNA呈负相关，与CD4+T细胞计数呈正相关[4-5]。而Tregs占CD4+T细胞的比例与HIV感染疾病的进展呈正相关，即Tregs占CD4+T细胞的比例越高，患者的病毒载量越高，CD4+T细胞水平越低[6]。但在极晚期患者中，Tregs细胞的比例高，与患者的生存能力及疗效呈正相关，即Tregs对于极晚期患者机体发挥有利的作用[6]。

滤泡调节性T细胞（follicular regulatory T cells, TFRs）是近年发现的表达CCR5的一个Tregs亚群，主要存在淋巴结生发中心[7]。生发中心是HIV感染的重要场所，TFRs也是HIV感染的靶标，由于TFRs具有Tregs细胞的特征，具有抑制免疫活化及免疫反应的作用，淋巴结生发中心也是免疫调节的重要场所，因此，TFRs与HIV感染疾病进展的关系非常复杂。有研究认为TFRs与HIV感染疾病进展呈负相关，即与CD4+T细胞计数呈正相关，与HIV RNA呈负相关[8]。了解TFRs占Tregs的比例与HIV感染疾病进展的关系，可以进一步了解Tregs亚群分布与HIV感染疾病进展的关系，为该疾病的治疗提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象 将2016—2020年于汉中三二〇一医院就诊和随访的HIV感染者纳入研究，共94例。其中未治疗HIV感染者54例，抗HIV治疗后免疫重建成功者23例，抗HIV治疗后免疫重建失败者17例。同时纳入性别（由于目前HIV感染者主要以男性为主，此次纳入的均为男性人群）和年龄相匹配的在汉中三二〇一医院健康体检者32例作为健康对照。入组HIV感染者的一般特征见表1。本研究获得医院伦理委员会批准。

表1 HIV感染者的一般特征Table 1 General characteristics of HIV infected patients

1.2 诊断标准与定义 HIV感染者的诊断标准参照《中国艾滋病诊疗指南（2018版）》[8]。免疫重建成功及免疫重建失败者的入排标准参考姜太一等[9]发表的文献：在抗病毒治疗的2年以上HIV感染者中，有一部分在病毒控制的同时，CD4+T细胞计数恢复到350 个/μl以上的HIV感染者称之为免疫重建成功者；另外一部分患者，虽然病毒控制的很好，但CD4+T细胞计数不能够很好的恢复，持续在250 个/μl 以下，并排除合并HBV、HCV及结核感染者，称之为免疫重建失败者。

1.3 HIV RNA及CD4+T细胞计数检测 利用罗氏cobas TaqMan HIV RNA检测系统进行HIV RNA水平的检测，应用BD公司的CD3+、CD4+及CD8+T细胞计数检测试剂盒进行CD4+T细胞计数的检测。

1.4 Tregs及TFRS检测 利用流式技术对外周血中的Tregs及TFRs进行检测。抽取外周抗凝血10 ml，首先用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞，Tregs及TFRs的染色方案见参考文献[9]。

1.5 统计学处理 使用SPSS 24.0软件对数据进行统计学分析，采用GraphPad Prism 8.0 软件进行绘图。一般资料采用描述性分析，计量资料采用中位数（最小值，最大值）表示。组间比较采用Mann–Whitney U 检验。相关性分析采用Spearman相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TFRs/Tregs比值与疾病进展的相关性分析 在HIV感染过程中，HIV RNA水平及CD4+T细胞计数是反应疾病进展的2个重要指标。本研究首先分析了未治疗HIV感染者TFRs/Tregs比值与HIV RNA及CD4+T细胞计数之间的关系，发现TFRs/Tregs比值与HIV RNA呈负相关（r=-0.276，P=0.044）（图1 A），与CD4+T细胞计数呈正相关（r=0.579，P=0.001）（图1 B）。

图1 未治疗HIV感染者TFRs/Tregs比值与HIV RNA及CD4+ T细胞计数之间的相关性分析Figure 1 Correlation analysis between TFRs/Tregs ratio, HIV RNA and CD4+ T cell count in untreated HIV infected patients

2.2 不同CD4+T细胞水平未治疗HIV感染者TFRs/Tregs比值的比较 一般CD4+T细胞计数＜200个/μl，HIV感染者进入疾病的晚期，即艾滋病期。CD4+T细胞计数在200～350个/μl之间，疾病进入进展期。CD4+T细胞计数＞350个/μl，机体能保持较好的免疫水平。我们根据CD4+T细胞水平的不同，将纳入的HIV未治疗者分为3组（CD4+T细胞计数≤200个/μl组、200个 /μl＜CD4+T 细胞≤ 350个 /μl组、CD4+T细胞计数＞350个/μl组），并对比分析各组之间TFRs/Tregs比值的差异，发现CD4+T细胞计数＜200个/μl的HIV感染者，其TFRs/Tregs比值明显低于健康对照组及其他2组（图2）。

图2 不同CD4+ T细胞水平未治疗HIV感染者与健康对照组，TFRs/Tregs比值的比较Figure 2 Comparison of TFRs/Tregs ratio between untreated HIV infected patients with different CD4+ T cell levels and health controls

2.3 免疫重建成功和免疫重建失败者TFRs/Tregs比值的比较 研究发现免疫重建失败组的TFRs/Tregs比值明显低于免疫重建成功组及健康对照组（P均＜0.05）（图3）。

图3 TFRs/Tregs比值在免疫重建成功和免疫重建失败者中的比较Figure 3 Comparison of TFRs/Tregs ratio in patients with successful and failed immune reconstitution

3 讨 论

TFRs是近年发现的一群新的细胞亚群，主要存在于淋巴结[7]，部分存在于外周血。TFRs一方面具有Tregs的特征，具有抑制免疫活化及免疫反应的作用，另一方面也具有滤泡辅助性T细胞的特征，具有辅助B细胞发育及辅助免疫反应的作用。在HIV感染过程中Tregs与疾病进展的关系报道较多，对于TFRs与HIV疾病进展的关系，有研究认为与Tregs是一致的[9]。由于TFRs主要存在于淋巴结，淋巴结生发中心也是CD4+T细胞的富集地，并且相对于外周血，淋巴结的结构致密。因此HIV在淋巴结中的感染率及复制水平远高于外周血[10]。此外，淋巴结中免疫反应的复杂程度远高于外周血。外周血中的TFRs的变化与淋巴结中的一致[7]。因此，充分了解TFRs占Tregs的比例与HIV感染疾病进展的关系可进一步了解Tregs及其亚群与HIV感染疾病进展之间的关系。

在本研究中，我们发现TFRs占Tregs的比例与HIV感染疾病进展呈负相关，也就是TFRs占Tregs的比例越高，对机体越有利；也说明CD4+T细胞越低，虽然Tregs和TFRs都受损，但TFRs受损更严重。这可能与TFRs除了具有抑制作用外，还有辅助免疫反应的作用有关。研究表明，TFRs主要存在的淋巴结生发中心也是B细胞发育的重要场所，B细胞发育也需要TFRs的辅助作用[11]，TFRs的损伤是否导致其辅助B细胞的作用减弱，从而B细胞抗病毒作用减弱加速了疾病进展，值得进一步研究。

此外，我们还发现免疫重建成功者中TFRs/Tregs的比例远高于免疫重建失败者。有研究表明，与免疫重建成功者相比，免疫重建失败者之所以长期抗病毒不能恢复期免疫水平，可能与病毒严重破坏了胸腺及淋巴结结构有关。免疫重建失败者TFRs/Tregs比例较低，可能与TFRs主要存在于淋巴结，淋巴结结构破坏严重，TFRs很难恢复有关[12]。

总之，TFRs是近年发现的Tregs的一个亚群，本研究对TFRs/Tregs比值与HIV疾病进展的关系进行了研究，结果显示与HIV RNA呈负相关，与CD4+T细胞计数呈正相关，比例越高，机体的免疫状态有可能越好。但因TFRs主要存在于淋巴结，本研究没有对淋巴结中的TFRs进行研究是本研究的不足之处。