五苓散对2型糖尿病小鼠糖脂代谢及心肌损伤保护作用研究

蔡志敏,马宇鹏,肖 姗

(北京中医药大学深圳医院(龙岗)，广东 深圳 518000)

2型糖尿病为临床中常见的代谢性疾病，如不及时干预，可能会导致心肌损伤、周围神经病变、肾病和视网膜病变等多种并发症[1]。目前临床中治疗糖尿病的药物有限，且多数药物在临床应用过程中已出现耐药现象，部分糖尿病患者已不能通过使用单一药物将血糖控制在正常水平，所以明确糖尿病的发病机制、研发更有效的治疗药物是研究重点。白细胞介素-32(IL-32)是新发现的一种促炎因子，其会诱导白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8 (IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子及相关信号通路的激活，加重糖尿病血糖异常及心肌损伤[2-3]。五苓散是以中医理论为基础，由中药饮片组成的成方制剂，用于糖尿病及其并发症的治疗效果较好[4]，但其作用机制尚不清楚。本实验观察了五苓散对2型糖尿病小鼠血糖、血脂、炎症因子及心肌损伤的影响，旨在为五苓散的临床应用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 C57BL/6J雄性小鼠50只， SPF级，8周龄，体重18～20 g，购自中山大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2016-0029。小鼠饲养于动物房，自由饮食，昼夜交替光照/12 h，温度20～24 ℃，湿度40%～70%。

1.2药品及试剂 五苓散由猪苓(批号：190711)9 g、茯苓(批号：181226)9 g、白术(批号：190910)9 g、泽泻(批号：190809)15 g、桂枝 (批号：190812) 6 g组成，药材饮片购于北京同仁堂药业有限公司，将药材饮片加入1 500 mL水煎煮2 h，蒸发浓缩，制成生药含量为2 g/mL的制剂。二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370，批号：201906121)；IL-32兔多克隆抗体(赛默飞世尔科技有限公司，货号：PA5-86627)，链脲佐菌素(STZ)、IL-6、IL-8兔多克隆抗体及TNF-α兔单克隆抗体(北京索莱宝科技有限公司，货号：IS0250，K009385P，K009504P，K009343M)；小鼠糖化血红蛋白ELISA试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，货号：ARB13293)；小鼠IL-32 ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司，货号：IHC0105454)；IL-6及TNF-α ELISA试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、组织裂解液(碧云天生物科技有限公司，货号：PI326，PT512，A0208，P0013B)；IL-8 ELISA试剂盒(上海延慕实业有限公司，货号：FK-bc2854)；RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒、HE染色试剂盒(万类生物科技有限公司，货号：WLA088，WLA101，WLA004，WLA051)；PCR引物设计及合成由赛默飞世尔科技有限公司完成。

1.3仪器与设备 WD0228血糖测定仪(上海榕柏生物技术有限公司)；M16RS高速台式冷冻离心机(北京乾明基因技术有限公司)；DMi8荧光倒置显微镜(德国Leica公司)；HS-3345石蜡切片机(上海信裕生物科技有限公司)；SPCC-6D石蜡包埋机(东莞市谱标实验器材科技有限公司)；iQ5TM PCR检测系统(美国Bio-Rad公司)；GIS-500凝胶成像仪(米欧仪器有限公司)；PUZS-300全自动生化分析仪(上海帝博思生物科技有限公司)。

1.4造模、分组及干预 将50只小鼠随机分为空白组、模型组、五苓散低剂量组、五苓散高剂量组、二甲双胍组，每组10只。除空白组外，其余组小鼠参照文献[5]方法，采用高脂饲料喂养4周后，按照50 mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ建立糖尿病小鼠模型，72 h后使用血糖仪测定空腹血糖和餐后血糖，以空腹血糖>7.0 mmol/L、餐后血糖>11.0 mmol/L视为造模成功。小鼠造模完成后，五苓散低、高剂量组参照文献[6]中给药剂量分别灌胃3.7 g/kg、11.0 g/kg(以生药含量计)的五苓散，二甲双胍组参照文献[7]中给药剂量灌胃200 mg/kg的二甲双胍，空白组及模型组灌胃等量生理盐水，均1次/d，连续灌胃8周。

1.5检测指标及方法

1.5.1空腹血糖 末次给药24 h后，小鼠禁食12 h，每组取5只小鼠，尾静脉取血，使用血糖测定仪测定空腹血糖。

1.5.2糖化血红蛋白及血清TC、TG、LDL-C、IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α水平 每组取5只小鼠，断头取血至干净离心管中，室温放置1 h，在4 ℃条件下，8 000 r/min离心(离心半径15 cm)10 min，取上清，采用全自动生化分析仪测定血清TC、TG、LDL-C水平，按照试剂盒说明书测定糖化血红蛋白及血清IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.5.3心肌组织HE染色病理观察 每组取5只小鼠，处死后分离心肌组织，用10%中性福尔马林固定24 h后，脱水、透明处理，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，经常规HE染色后，在光学显微镜下进行观察。

1.5.4心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达量 每组取5只小鼠心肌组织，按照RNA提取试剂盒说明书提取心肌组织RNA，使用cDNA合成试剂盒将从心肌组织中提取到的RNA反转录为cDNA。采用RT-qPCR试剂盒测定心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达量，结果以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算。各基因引物序列：IL-32正向引物为5’-CTGTGCCAATGGCCTCAAAC-3’，反向引物为5’-GCCCATCGAAGGTGACAAAG-3’；IL-6正向引物为5’-GTGGCAGCTACCTATGTCTTGC-3’，反向引物为5’-CCACTTGTTGGCTTATGTTCTGT-3’；IL-8正向引物为5’-CGACCGAACAGCCAACGAAT-3’，反向引物为5’-GGGTCACAGCCAGTCCTCTT-3’；TNF-α正向引物为5’-CACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3’，反向引物为5’-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3’；GAPDH正向引物为5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，反向引物为5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.5.5心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表达量 每组取5只小鼠心肌组织，用含蛋白酶抑制剂组织裂解液处理心肌组织，研磨匀浆后，4 ℃条件下，12 000 r/min离心(离心半径15 cm)10 min，取上清液，采用BCA蛋白测定试剂盒检测总蛋白质浓度，取相当于50 μg的蛋白样品上样至聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，按照蛋白分子量将目标蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，使用5%脱脂牛奶在室温下封闭1 h，分别经IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α及GAPDH抗体(1∶500稀释)在4 ℃条件下孵育过夜，经TBST洗涤3次，每次5 min，再使用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)室温孵育1 h，在凝胶成像系统中观察结果并拍照，用ImageJ1.6.0软件定量分析各蛋白表达量。

2 结 果

2.1各组小鼠空腹血糖及糖化血红蛋白比较 模型组小鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平均显著高于空白组(P均<0.05)；五苓散低、高剂量组及二甲双胍组小鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且五苓散高剂量组及二甲双胍组均显著低于五苓散低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和糖尿病各组小鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平比较

2.2各组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平比较 模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均显著高于空白组(P均<0.05)；五苓散低、高剂量组及二甲双胍组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且五苓散高剂量组及二甲双胍组均显著低于五苓散低剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组和糖尿病各组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平比较

2.3各组小鼠血清IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α水平比较 模型组小鼠血清IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著高于空白组(P均<0.05)；五苓散低、高剂量组及二甲双胍组小鼠血清IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且五苓散高剂量组和二甲双胍组均显著低于五苓散低剂量组(P均<0.05)。见表3。

表3 空白组和糖尿病各组小鼠血清IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α水平比较

2.4各组小鼠心肌组织病理表现 空白组小鼠心肌组织结构正常，无明显病理性改变；模型组小鼠心肌组织细胞排列紊乱，肌纤维增粗，炎性细胞浸润；与模型组比较，五苓散低、高剂量组及二甲双胍组心肌组织炎症细胞浸润减轻，细胞排列较整齐，心肌组织病理学明显改善。见图1。

图1 空白组和糖尿病各组小鼠心肌组织HE染色表现

2.5各组小鼠心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达量比较 模型组小鼠心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达量均显著高于空白组(P均<0.05)；五苓散低、高剂量组及二甲双胍组小鼠心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达量均显著低于模型组(P均<0.05)，且五苓散高剂量组及二甲双胍组均显著低于五苓散低剂量组(P均<0.05)。见表4。

表4 空白组和糖尿病各组小鼠心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达量比较

2.6各组小鼠心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表达量比较 模型组小鼠心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表达量均显著高于空白组(P均<0.05)；五苓散低、高剂量组及二甲双胍组小鼠心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表达量均显著低于模型组(P均<0.05)，且五苓散高剂量组及二甲双胍组均显著低于五苓散低剂量组(P均<0.05)。见图2。

图2 空白组和糖尿病各组小鼠心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表达情况

3 讨 论

2型糖尿病多于30岁后发病，其发生与遗传因素、环境因素、生活方式等多种因素密切相关[8]。中医学将糖尿病统称为消渴症，其病机为阴津亏耗，燥热偏盛，消渴日久，阴损及阳，阴阳俱虚，络脉瘀阻，最终导致经脉失养，气血逆乱，累及胃、肾等多个组织器官。由于机体长期处于高血糖状态，会导致体内脂代谢紊乱，进而会损伤血管及心肌组织，可导致心肌组织细胞损伤，心肌纤维化，引起心肌收缩及舒张功能障碍，最终进展为心力衰竭[9]。

二甲双胍是药理作用机制明确的一线治疗2型糖尿病的药物，所以本研究使用二甲双胍作为阳性对照药物。五苓散最早记载于《伤寒论》，用于治疗阳气不化、水湿内停等证。动物研究发现，五苓散可改善非酒精性脂肪性肝病大鼠脂代谢,减缓脂肪变性程度[10]；还可改善肾间质纤维化，保护糖尿病视网膜病变大鼠的血-视网膜屏障[11-12]。郝成诗[13]临床研究表明，五苓散联合瑞格列奈可有效控制肥胖型2型糖尿病患者血糖、血脂及体重，且效果优于单独使用瑞格列奈；陈青梅[14]报道，西药联合五苓散能有效控制肥胖型2型糖尿病患者的餐后血糖、空腹血糖及总胆固醇水平，且效果优于单独西医治疗；敬仁芝等[15]研究表明五苓散联合罗格列酮能够显著降低糖尿病肾病患者血糖、血脂、尿蛋白水平，改善肾功能。本实验结果显示，模型组小鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、TC、TG、LDL-C水平均明显增高，心肌组织有炎性细胞浸润；五苓散低、高剂量组小鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、TC、TG、LDL-C水平均明显低于模型组，心肌组织炎性细胞浸润减轻。提示五苓散能够显著降低糖尿病小鼠血糖水平，调节血脂代谢，抑制心肌组织炎症性改变。

近年研究证实，IL-32在2型糖尿病及其诱导的心肌损伤中发挥着重要作用， 2型糖尿病患者体内IL-32水平与体重指数、空腹血糖呈正相关，其能够促进炎症因子的释放，进而诱导并加重心肌损伤[16]。方毅等[17]研究表明心肌细胞损伤与IL-32表达水平升高显著相关。刘宇宏等[18]研究发现IL-32γ会促进大鼠血管平滑肌细胞增殖，上调NF-κB p65和cyclin D1的表达，进而加重体内炎症反应。余渊等[19]报道TNF-α及IL-6水平升高会影响2型糖尿病大鼠脂代谢，抑制TNF-α及IL-6水平能够促进糖尿病大鼠血脂恢复至正常水平。丁海燕等[20]研究发现，IL-6、IL-8、TNF-α水平升高会加重心肌缺血再灌注损伤，而降低IL-6、IL-8、TNF-α水平则能够显著抑制心肌细胞凋亡，缓解心肌细胞损伤。本实验结果显示，模型组小鼠血清及心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著升高，五苓散低、高剂量组小鼠血清及心肌组织中IL-32、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著降低，提示五苓散能够显著下调2型糖尿病小鼠IL-32水平，进而抑制小鼠体内炎症因子的释放，减轻小鼠心肌组织损伤。

综上所述，五苓散能够有效控制2型糖尿病小鼠血糖水平，调节脂代谢，修复心肌损伤，其机制可能与下调IL-32水平，抑制相关炎性因子的释放，减轻炎性损伤有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。