龙杞方治疗糖尿病肾脏病的作用机制：基于网络药理学和大鼠验证实验

糖尿病（DM）是我国目前患病率最高的慢性疾病之一，伴随着我国老龄化的进展和生活方式的改变，我国糖尿病的发病率也不断升高，在2018年国际糖尿病联合会发布的《IDF全球糖尿病概览·第九版》中指出截止2019年20～70岁全球糖尿病患者的数量达到4.63亿，而我国糖尿病患者的数量达到1.164亿，高居全球第一，其患病率约占总人口的10.9%。糖尿病肾脏病（DKD）是最令人担忧的糖尿病慢性微血管并发症之一，也是终末期肾病（ESRD）的主要原因。DKD患者的全因死亡率约为无肾病的糖尿病患者的30倍。现代医学治疗DKD的主要方法以控制血糖、调节脂质代谢、控制血压、抗氧化应激、抑制炎症因子等为主，但是临床疗效欠佳，最终方式以肾脏血液净化为主，故寻找有效阻止/延缓早期DKD的药物尤为重要。

龙杞方是郭宏敏教授的经验方（专利：ZL201310565771.0），在治疗早期DKD患者方面疗效显著，其组成主要为：制黄精、干地龙、红景天、川芎、荷叶、三七粉、葛根、生地、枸杞，以黄精为君药。长期临床观察发现龙杞方能有效改善早期慢性肾功能不全患者的尿蛋白水平，相关的实验研究发现龙杞方能有效改善胰岛素抵抗、对血管炎症因子有抑制作用，能起到保护血管内皮细胞的作用。但由于龙杞方由多味中药组成，成分多而复杂，其靶点多，作用机制多，目前无法完全阐明龙杞方治疗DKD的药理机制。因此，本研究采用网络药理学方法，获得龙杞方治疗DKD的潜在靶点和信号通路，探讨龙杞方治疗DKD的可能机制，并通过动物实验进一步验证分析，为龙杞方的临床应用以及DKD相关疾病基础与临床研究提供一定的理论依据。

1 资料和方法

1.1 网络药理学方法

1.1.1 糖尿病肾脏病GEO 芯片筛选差异基因 通过NCBI 基因表达数据库（GEO）中GEO datasets 以“Diabetic kidney disease”作为为检索词，获取GSE30528和GSE30529相关芯片，其芯片分别对应肾小球及肾小管，两组芯片为同一实验，两者的注释文件为同一平台GPL571。对获得的芯片数据进行二次分析，使用limma包对芯片数据的差异基因进行分析，为了得到更多的差异基因，将显著差异基因的筛选条件设定为及校正后的均小于0.05，logFC的绝对值大于1，得到名为“diff”的差异基因文件，运用phearmap包，分别筛选出上调与下调基因，绘制差异基因的热图，运用plot包绘制火山图。

1.1.2 龙杞方潜在活性成分和靶点筛选 通过TCMSP数据库，输入龙杞方中9味中药名称，即三七、地龙、荷叶、红景天、葛根、地龙、枸杞、川芎、生地黄、黄精，搜索得到各药化学成分，通过口服生物利用度（OB）及类药性（DL）的筛选条件（OB≥30%，DL≥0.18）进行筛选。在TCMSP中无法获取相关药物药物成分和靶点的中药，使用中国知网数据库和PubMed数据库进行检索，获取中药化学成分有关的文献，搜集其有效化学成分，使用ChemDraw软件绘制相关化合物的分子结构，以sdf（*.sdf）格式保存文件。将获得的中药化学成分的sdf 格式文件上传到Swiss ADME平台，对候选化合物和类药性相关参数进行预测，预测标准为：Pharmacokinetics项筛选肠胃吸收为“High”，同时Druglikeness项中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge，这5个类药性预测中有≥2个以上为“Yes”的化合物，符合上述标准的为类药性和口服利用度较好的活性化合物。将获得的活性化合物以sdf 格式文件上传至SwissTargetPrediction 平台，“Organism”选择“Homo Sapiens”，筛选条件为probability＞0.1，预测潜在靶点，建议活性化合物-靶点数据库。

1.1.3 蛋白互作网络构建及核心靶点筛选 通过VENNY软件得到的龙杞方与DKD的交集靶点导入到STRING数据库，物种设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“High confidence(0.400)”，构建PPI网络。将PPI网络的tsv文件导入Excel表格，利用R 软件进行可视化处理，并选出核心靶点。

1.1.4 GO和KEGG分析 利用R软件对上述筛选出的药物疾病共有靶点进行GO和KEGG分析，种属选为“Homo sapiens”，以≤0.01且从小到大排序作为筛选条件，选取符合条件的前20的KEGG通路及GO生物过程、细胞成分、分子功能，绘制GO和KEGG气泡图及柱状图。

2.1.1 GEO数据库芯片获取 依据上述方法，通过对正常基因和DKD肾脏组织标本进行分析，GSE30528芯片中符合及校正后的均小于0.05，logFC的绝对值大于1为筛选条件的差异基因有542个，其中上调的基因75个，下调的基因467个，绘制前40位的差异基因热图（图1A），差异基因火山图（图1C）；在GSE30529芯片中符合及校正后的均小于0.05，logFC的绝对值大于1为筛选条件的差异基因有484个，其中上调的基因303个，下调的基因181个，绘制前40位的差异基因热图（图1B），差异基因火山图（图1D）。

1.2 动物实验

付玉看看天。天上有几只鸟雀飞过，像刀片在她记忆里划了一道黑色的弧线。马路两边的老槐树上，有蝉在叫，叫声像白花花的鱼鳞，瓦片般在地上滚动。

1.2.2 药物、试剂与仪器 中药：龙杞方由干地龙、制黄精、枸杞、葛根、生地黄、红景天、三七粉、川芎、荷叶组成，为江苏省中医院老年科临床专用方，其中药生药由南京市高淳中医院药剂科提供，按高、中、低剂量制成，其制备方法：将配方量干地龙、制黄精、枸杞、葛根、生地黄、红景天、三七粉、川芎、荷叶混合，放入3倍质量的蒸馏水，浸泡1～2 h左右，再加入3倍质量蒸馏水，煎煮1h，将滤液收集，使用同样的方法再重复煎煮3次，最后将所有收集的滤液汇总浓缩成浸膏进行过滤，按照高、中、低剂量将生药剂量定为4 g生药/mL、2 g生药/mL、1 g生药/mL，保存在4 ℃冰箱中备用。

链脲佐菌素（STZ，Sigma）；染色剂试剂盒、苏木精染液（BASO）；伊红染液（BASO）；NF-κB 多克隆抗体（EnoGene）；P-NF-κB多克隆抗体（EnoGene）。

1.2.3 STZ大鼠诱导的糖尿病肾脏病大鼠模型建立及药物干预方案 基于国内外DKD大鼠模型的造模方法，采用“高脂饲料喂养＋单侧肾切除+STZ腹腔注射”3种措施建立改良型的DKD大鼠模型。

所有大鼠在实验室适应性喂养1周后，按照随机数字表将40只大鼠随机分为正常组（8只）和造模组（32只）；正常组8只大鼠给予普通饲料喂养，造模组大鼠32只大鼠予高脂饲料喂养。32只造模组大鼠在高脂饲料喂养4周后，腹腔内注射丙戊酸钠进行麻醉，然后以俯卧位将其固定在鼠板上，消毒后沿大鼠左侧背部肋弓下缘纵向切开约3 cm大小切口，将左侧肾脏充分暴露，之后将肾周组织分离，对左侧肾门血管进行结扎后摘除左侧肾脏，最后将切口逐层缝合。术后3 d内在大鼠腹腔内注射青霉素钠（20万U/d）以预防感染。大约7 d后，造模组大鼠手术创面愈合后，在大鼠右侧腹腔内注射STZ（35 mg/kg），72 h后对大鼠尾静脉进行采血，3次随机血糖（RBG）监测均＞16.7 mmol/L，则提示DKD大鼠模型成功建立。若3次RBG中有＜16.7 mmol/L，再次注射STZ（35 mg/kg），直至DKD大鼠模型成功建立。

1.2.6 统计学方法 应用GraphPad Prism 5.0 和SPSS 25.0统计软件进行分析，采用-test检验对两组间均数进行比较，采用One-way Anova（Dunnett）对多组间比较。以均数±标准差记录正态分布定量资料，采用单因素方差分析及LSD法两两比较，不满足方差分析条件时采用Wilcoxon秩和检验，当＜0.05为差异有统计学意义。

给药方案：将32只造模大鼠按照随机数字表分为模型组8只，龙杞方高剂量组，中剂量组和低剂量组各8只，模型组自造模成功后不做任何干预，其余3组大鼠采用“按动物体表面积比率换算等计量法”计算出每组药物的临床等效剂量。龙杞方高剂量为20 g生药/kg，中剂量为10 g生药/kg，低剂量为5 g生药/kg，龙杞方药液按高、中、低剂量制成，生药剂量分别为4 g生药/mL、2 g生药/mL、1 g生药/mL，各组按照设定的剂量每日灌胃给药，给药体积为1 mL/200 g，连续给药8周。在最后1次灌胃结束后1 d取材，取材前隔夜禁食禁水＞10 h。

1.2.5 Wesrtern blot实验 对获得大鼠肾脏组织依据实验要求进行，提取总蛋白→凝胶电泳分离→转膜→抗体孵育→ECL显色等多重步骤，检测NF-κB多克隆抗体、P-NF-κB 多克隆抗体蛋白。

1.采油厂层面。实行培养工作目标管理责任制。将入党积极分子培养工作情况，纳入优秀基层党组织评选推荐和党组织负责人年度考核的参考指标。采油厂党委组织部门利用季度政工检查、“三基”创建检查等机会，通过随机抽取人员座谈、回答问卷等形式，对基层党组织入党积极分子培养工作进行检查，对培养过程记录和培养工作实效性进行量化，单独列入季度政工检查和“三基”创建排名考核依据，起到激励作用。

1.2.4 肾脏组织HE染色流程 大鼠肾脏切除固定后，通过乙醇阶梯脱水、二甲苯透明、石蜡包埋等多个步骤后，使用切片机制片，片厚5µm，依据HE染色试剂盒说明进行染色，并对肾脏组织进行HE评分。

对刚届不惑之年的宏波而言，年富力强的他已经拥有了一些颇有些“耀眼”的光环：国家一级美术师、杭州画院副院长、省美协理事、市美协副主席兼秘书长……宏波似乎是有些“大器早成”。然而，艺术无有穷期，前途无可限量。相信宏波会在他的艺术之旅上踏出一个又一个扎实的脚印。

2 结果

2.1 网络药理学结果

1.1.5 构建“龙杞方-成分-靶点-通路-疾病”网络图 通过对获得20条主要信号通路及其相关靶点及其映射的龙杞方成分，通过汇入Cytoscape 3.7.2软件中，构建“龙杞方-成分-靶点-通路-疾病”网络图。

2.1.2 龙杞方有效成分和靶点 通过检索TCMSP平台只获取了三七、荷叶、葛根、川芎、枸杞、黄精的所有成分，按照OB≥30%，DL≥0.18的标准筛得其对应的有效成分，其中三七有效成分7个，荷叶有效成分14个，川芎有效成分6个，枸杞有效成分35个，葛根有效成分3个，黄精有效成分9个。其对应的中药靶点三七223个，川芎39个，枸杞321个，荷叶358个，葛根76个，黄精133个。对于无法获得的中药红景天、地龙、生地黄，我们通过检索生地黄、地龙、红景天的相关文献检索其化合物，并通过Swiss ADME平台获得红景天有效成分47 个，地龙有效成分36 个，生地黄有效成分52个。通过SwissTarget Prediction平台预测并收集中药对应化合物的靶点，其中红景天有效成分47个，地龙有效成分36个，生地黄有效成分52个，核心靶点生地黄1008个，红景天1092个，地龙931个。将所有的中药靶点经过汇总去重后获得的靶点760个。

2.1.5 GO和KEGG分析 龙杞方治疗DKD的GO功能分析提示，KEGG通路富集分析结果共37条信号通路，其中主要有AGEs-RAGE、HIF-1、PI3K-Akt，NF-κB、TNF信号通路可能为重要的龙杞方治疗DKD的信号通路（图5）；其中20条与DKD密切相关的通路（表1）；利用R软件绘制前20名信号通路气泡图（图6）。

2.1.3 龙杞方-糖尿病肾脏病的共同靶点 将龙杞方的所有靶点与GSE30528、GSE30529的差异基因取交集，获得龙杞方与DKD相关发病机制的61个交集靶点基因，并通过Venny 2.1.0 软件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）绘制韦恩图（图2）。

2.1.4 PPI 网络及龙杞方治疗DKD 的主要靶点 将2.1.3项下得到的龙杞方作用与DKD的交集靶点导入到STRING数据库，物种设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“High confidence(0.150)”，构建PPI 网络（图3）。使用Cytoscape软件中的Network-Analyzer分析互作节点的度值，Degree值作为标准，找到排名前30的核心靶点，并使用R语言绘制核心靶点的柱状图（图4）。得到龙杞方治疗DKD的核心靶点为MYC、EGF、CASP3、VEGFA、CCL2、SPP1、VCAM1、ICAM1。

Ian是来自南半球的男子。27岁，电脑工程师。俊美，壮实，略带鲁莽和天真之气，此前生活读书工作一直在小城布里斯班度过。热衷户外运动，登山，滑板，出海，自助旅行，和漂亮女孩做爱。他是独子，备受父母宠爱，未必有过深刻的恋情，不过是18岁开始，与不同异性之间幼兽般的肌肤相亲，戏耍玩乐。这一年，他失恋，也不是惨痛经历，只是选择与人分手。于是给自己一个理由，挑选一个孤僻遥远的地点，抵达老挝。

2.1.7 构建“龙杞方-成分-靶点-通路-疾病”网络图 通过对获得20条主要信号通路中38个关键靶点及其映射的主要成分，将其汇入Cytoscape 3.7.2软件中，构建“龙杞方-成分-靶点-通路-疾病”网络图（图10）。

2.2 动物实验结果

2.2.1 生化指标检测 模型组大鼠血清生化指标Scr、BUN、UALB、UACR较正常组大鼠显著升高（＜0.01），龙杞方各剂量组大鼠经治疗后，血清生化指标Scr，BUN，以及尿蛋白指标UALB、UACR较模型组显著降低（＜0.01），效应强度为：龙杞方高剂量组＞中剂量组＞低剂量组（表2、图8）。

或许我的运气特别好，我指导的9名硕士研究生都非常优秀。除其中有3名在职研究生不能参与评选优秀毕业生外，6人中有3人毕业时被评为上海市优秀毕业生，有3人考取博士研究生，并3人晋升为副研究馆员或副教授职称。而且他们培养的硕士研究生同样十分优秀，据不完全统计，1人被评为上海市优秀毕业生，3人次获国家一等奖学金，1人被评为“上海大学学术启明星”，1人考取南开大学博士研究生等。

私人、个体医疗机构可以作为我国医疗体系的重要组成部分，是公有制医疗机构的补充和完善，不能与公有制医疗机构享有同等地位。在医疗领域，不能以市场经济的观念来对待公有制医疗与私营、个体医疗。生病、看病不能看作是商品，不能由市场来主导，不能通过价格竞争、独特服务，让私人或个体医疗来引导或冲击公有制医疗。

2.2.2 Western blot结果 与模型组对比，药物浓度在高剂量（4 mg/mL）、中剂量（2 mg/mL）时NF-κB、P-NF-κB蛋白表达均有所下调（＜0.01）。与模型组对比，药物浓度在低剂量（1 mg/mL）时NF-κB、P-NF-κB的蛋白表达水平有所下调（＜0.05，表3、图9）。

1.2.1 动物 SPF 级SD 大鼠40 只，雄性，体质量180～200 g，购于南通大学动物实验中心。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2019-0001。实验动物使用许可证：SYXK（苏）2017-0007。

2.2.3 HE染色结果 对构建DKD大鼠模型，使用不用剂量的龙杞方进行干预，HE染色结果显示模型组的肾小管上皮细胞重度变性坏死，管腔轻微增大，腔内见大量透明管型；肾小球内细胞数增多、毛细血管扩张，系膜基质无增生，球囊腔无扩大；间质无炎细胞浸润，无纤维组织增生。龙杞方干预组与模型组相比，改善明显，效应强度为：龙杞方高剂量组＞中剂量组＞低剂量组（图10）。

3 讨论

DKD是糖尿病重要的微血管并发症之一，由于其发病机制复杂，目前尚无统一定论，但普遍认为与炎症反应、遗传因素、代谢紊乱、氧化应激、血流动力学等相关。根据流行病学统计研究，20%～40%的糖尿病患者会出现DKD，预计到2030年，世界范围内的DM患者将达到3.66亿，而DKD患者将超过1亿，开展防治DKD 的研究工作已经刻不容缓。现代医学认为DKD的发病机制与多重因素有关，如持续的高血糖状态引起的糖基化合物增加，氧化应激反应增强，肾脏血流动力学的改变。现代中医学家仝小林院士认为DKD在中医上属于“消渴肾病”的范畴，认为其发病的病机主要为痰浊、肾虚、血瘀导致，导师郭宏敏教授使用龙杞方治疗DKD患者，临床疗效显著，全方以标本同治为治则，具有活血化瘀、升清降浊、益气养阴、清热剔络之功效，切合DKD患者痰浊、肾虚、血瘀的发病机制。目前龙杞方在临床上使用较为广泛，但是缺乏有效的理论和实验基础，对龙杞方作用于DKD的多靶点、多途径的作用机制缺乏客观的认识。本文通过GEO数据库结合网络药理学研究方法，通过“疾病、药物、靶标、通路”有机结合，进一步研究龙杞方作用于DKD的研究机制。

比如，近期关于人工饲养、出售濒危野生动物而获刑的案件就曾引发广泛讨论。相对应的，《规划》提到，进一步修订完善涉野生动物和国家重点保护植物相关犯罪案件的司法解释。

本次研究得出龙杞方治疗DKD的61个交集靶点，并通过PPI网络互作分析以及R语言软件获得龙杞方治疗DKD的前8位的主要靶点为MYC、EGF、CASP3、VEGFA、CCL2、SPP1、VCAM1、ICAM1，说明龙杞方可能是通过作用以上靶点从而对DKD发挥直接或者间接的调控作用。并通过“龙杞方-成分-靶点-通路-DKD”网络图筛选出龙杞方治疗DKD的主要核心成分为槲皮素、山奈酚。研究发现槲皮素调控NF-κB信号通路，减轻炎症反应，抑制DKD大鼠的肾脏纤维化。Chen等研究发现山奈酚可以通过抑制NF-κB信号通路减轻高血糖诱导的心脏损伤。

通过GO和KEGG分析龙杞方治疗DKD具有多成分、多靶点、多通路的特点，发现龙杞方可能通过上皮细胞增殖的调控、内皮细胞调控、白细胞-细胞粘附等过程发挥保护DKD大鼠的作用，其作用机制可能与PI3KAkt、NF-κB、TNF等炎症信号通路相关。

NF-κB作为核转录因子的代表，不仅在正常的生理活动中，其异常活化也与许多疾病紧密相关，研究报道肾病患者中NF-κB表达的水平的增高显著，其形成的信号通路表达水平高低可作为肾病预后的判断标准。动物实验结果显示，龙杞方通过调控NF-κB信号通路进一步改善DKD的病理生理功能。NF-κB信号通路是多种信号通路的枢纽，NF-κB向细胞核内转移并导致促炎因子启动，导致细胞炎症反应增加，组织炎症损伤。在高血糖状态下，导致NF-κB激活，参与高血糖诱导下细胞凋亡。相关实验研究表明通过抑制NF-κB信号通路的磷酸化激活可以有效改善DKD的病程进展。通过HE病理染色可以发现龙杞方可能通过抑制NF-κB信号通路，减轻DKD大鼠的炎症反应，减缓DKD大鼠肾脏纤维化的进展。

The mean crystallite size of the line broadening of the(101) plane was evaluated by using the Scherrer formula[17],

本研究通过不同浓度的龙杞方对DKD大鼠进行干预，观察其对肾功能损伤指标的改善情况。发现相关肾功能指标Scr，BUN、UALB、UACR均有显著变化，效应强度为：龙杞方高剂量组＞中剂量组＞低剂量组。表明龙杞方可有效改善DKD大鼠的肾功能。通过对DKD大鼠的临床症状有较为明显的改善，说明龙杞方在改善DKD大鼠的蛋白尿、肌酐、尿素氮以及临床症状上有较为明显的疗效，具有保护肾脏的作用。

综上所述，通过GEO数据库与网络药理学分析龙杞方治疗DKD的核心靶点，GO和KEGG分析以及筛选得到龙杞方治疗DKD的核心信号通路和分子机制。通过动物实验证实龙杞方能有效改善DKD大鼠的肾功能，同时龙杞方可以抑制炎症信号通路NF-κB，减轻炎症反应，抑制肾脏纤维化起到保护肾脏的作用。