萘烯丙基三氟甲基苯并环戊酮抑制肺癌A549 细胞增殖并诱导其凋亡

肺癌是世界范围内癌症死亡率最高的肿瘤之一，据统计每年有180 多万人患有肺癌，160 多万人死于该病。近年来，在肺癌发病机制研究、肺癌早期筛查和个性化治疗（精准医疗）方面取得很大进步，但患者5年生存率仍然低于17%。因此，发现有效的化疗药物对于延长肺癌患者的生命及改善其生活质量尤为重要。

2.技术进步会吸引更多的消费者，提升用户的认可度，这是促进我国电动汽车市场发展的重要因素。市场观察显示，消费者比较关注电动汽车的性能、价格以及其配建设施的完善程度等。最近十年，我国纯电动汽车的电池、燃料电池，核心技术的不断进步发展、成本逐渐降低、相关基础设施不断完善，同时我国电动汽车行业长期的探讨，出台了相关政策及规划，都表明了这种态势将长期持续增长。目前我国各城市对汽车的需求均为刚性需求，在未来，这种需求将会改变。在一线城市变为更新为主，二三线城市及新兴城市则继续保持以刚性需求为主，两者都保持增长之势。伴随着我国人均可支配收入的提高，电动汽车消费将大幅增加。

近年来，含三氟甲基类化合物的抗肿瘤活性陆续被发现，如吉非替尼对晚期非小细胞肺癌有抗肿瘤活性，该药物能够抑制肿瘤的生长，促进肿瘤细胞凋亡；索拉非尼作为一种新型治疗肿瘤的口服药物，能够治疗晚期无法进行手术治疗的肝细胞癌；拉帕替尼是一种可以用于晚期乳腺癌的化合物，这些含三氟甲基类化合物的发现与应用，提高了患者的生存率。据报道，含氟类药物比不含氟的药物具有毒性低、药效高、代谢能力强等特点，已成为抗肿瘤药物研发的一个新的热点，但也存在合成产物产量较低等问题。因此，发现新的具有抗肿瘤活性的含氟化合物，将为肿瘤的临床治疗提供新的潜在药物。

本研究前期的结果表明，不对称引入CF单元是改变药动学性质和减缓药物代谢的有力工具，根据计算并同时优化合成方法，合成了萘烯丙基三氟甲基苯并环戊酮。新合成的萘烯丙基三氟甲基苯并环戊酮，代号为XX0335，但该化合物是否具有抗肿瘤尤其是抗肺癌活性尚不明确，有关其抗肿瘤活性的研究未见报道。Akt/mTOR信号通路参与调节细胞的活力、增殖和生长等多种生物学过程，其异常表达会导致细胞增殖发生异常。研究表明，该信号通路的异常影响了多种肿瘤（包括肺癌）的细胞增殖。本研究发现XX0335抑制了肺癌细胞系A549的增殖，由于Akt/mTOR信号通路是最常见的影响细胞增殖的信号通路。因此，本研究首先从体内外水平探索了新型含三氟甲基的化合物XX0335对A549细胞的活力、增殖、周期及凋亡的影响，并探索了该化合物对Akt/mTOR信号通路的影响，为其能否应用到肺癌的临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

萘烯丙基三氟甲基苯并环戊酮（代号为XX0335，纯度为99%，结构式见图1），为南京大学化学化工学院合成；DMEM培养基（Gibco）；胰酶（Gibco）；胎牛血清（Sigma）；CCK-8试剂盒、细胞凋亡试剂盒（北京凯基生物）；细胞周期检测试剂盒（北京凯基生物）；RIPA裂解液（北京碧云天生物）；BCA 蛋白浓度检测试剂盒（Thermo Fisher）；DMSO（Sigma）；I抗GAPDH、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1、cleaved PARP（Cell Signaling Technology）；人肺癌A549细胞（中科院上海细胞库）；山羊抗兔Ⅱ抗（Santa cruz）、山羊抗鼠Ⅱ抗（Santa cruz）。

CCK-8实验结果显示，与溶剂对照组相比，不同浓度的XX0335处理A549细胞24 h后，细胞的活力受到抑制且呈现剂量依赖性（图2A，＜0.01），其IC为9.631 μg/mL（图2B）。

1.2 细胞培养

动物研究方案经皖南医学院动物伦理委员会批准同意。无胸腺裸鼠（BALB/c-nu，中国，南京）购于南京大学模式动物所，饲养于皖南医学院SPF级动物房，本实验使用4周龄小鼠共10只，随机平均分为2组。将2×10A549细胞植入小鼠左侧腋下，待26 d后瘤体长径长至1 cm时，对照组小鼠注射无菌生理盐水（200 μL），对实验组注射化合物XX0335（12.5 μg/mL，200 μL），隔天注射1次，共5次之后取肿瘤观察每组瘤体大小。

实验分组：本实验共分为4 组，包括对照组（含0.1%DMSO的培养液）、不同浓度（6.25、12.5、25 μg/mL）XX0335（该化合物需DMSO 溶解，但工作浓度中DMSO的终浓度均低于0.1%）。

1.3 CCK-8实验

按照前述方法处理A549细胞，24 h后消化收集细胞。用PBS清洗1次，加入70%的乙醇固定过夜。2000 g离心5 min，弃上清。PBS清洗1次，加入0.5 mL配制好的碘化丙啶染色液，37 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪（Beckman cytoflex）上机检测，结果通过系统自带的软件CytExpert进行分析。

1.4 EdU实验

XX0335处理A549细胞24 h后，凋亡细胞比例与溶剂对照组相比显著增加。对第2和第3象限的凋亡细胞进行统计分析表明，XX0335诱导A549细胞凋亡，且呈现剂量依赖性（＜0.01，图5A、B）。

1.5 细胞凋亡检测

众所周知，保证睡眠的时间和质量对身体健康极为重要，尤其是对于青少年而言，缺少睡眠会增加患肥胖症和Ⅱ型糖尿病的风险。据法国健康杂志《TOPSANTE》报道，美国休斯顿大学的研究表明，睡眠时间不足或睡眠质量较低的青少年患抑郁症和焦虑症的风险很高。

他不在看她，脸上的微笑有点悲哀。本来以为想不到中年以后还有这样的奇遇。当然也是权势的魔力。那倒还犹可，他的权力与他本人多少是分不开的。对女人，礼也是非送不可的，不过送早了就像是看不起她。明知是这么回事，不让他自我陶醉一下，不免怃然。

1.6 细胞周期检测

将A549细胞培养于96孔板中，待细胞融合度达到80%，按实验分组分别加入不同浓度（6.25、12.5、25μg/mL）的XX0335，培养24 h后弃去上清液加入CCK-8检测液，培养2 h后用酶标仪测定其吸光度。

例3 Each time，there have been those who told us to fear the future;who claimed we could slam the brakes on change;who promised to restore past glory if we just got some group or idea that was threatening America under control．

1.7 Western blot检测蛋白表达

将A549细胞培养于6孔板中，待细胞生长到90%后按照前述方法处理细胞。24 h 后收集细胞，加入RIPA裂解液提取细胞蛋白。各组蛋白浓度通过BCA蛋白测定试剂盒测定，随后加入蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min。按照60 μg/孔的加样量进行SDSPAGE（下层胶浓度为10%）电泳，完成后将蛋白转移到PVDF膜（甲醇浸润处理）上。将PVDF膜用含5%脱脂奶粉的BSA溶液封闭，室温孵育1 h。加入稀释后的GAPDH、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1 和cleaved PARPI抗（所有I抗稀释比例均为1∶1500），4 ℃放置一夜。随后，用TBST清洗3遍后加入稀释好的Ⅱ抗（1∶5000），室温孵育1 h，TBST清洗3遍。最后将PVDF膜放入暗盒中，正面向上，加入发光液，暗室压片曝光。

1.8 动物实验

人肺癌细胞系A549使用DMEM（含10%的胎牛血清）培养基进行培养。将A549 细胞培养在含有5%CO、37 ℃的恒温培养箱中。待细胞达到对数生长期后进行实验。

1.9 统计学分析

统计学方法采用SPSS19.0软件。所有数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析。每组实验重复3次，＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 XX0335抑制肺癌A549细胞活力

按照上述分类标准，根据第1.1节中船舶领域统计模型，分别对4类目标船周围最近船舶相对其运动的轨迹最近距离时刻的相对位置分布进行统计，得到图7。

2.2 XX0335抑制肺癌A549细胞增殖

EdU结果显示，XX0335处理A549细胞24 h后，与对照组相比，细胞的增殖受到抑制，且呈现剂量依赖性（图3A、B）。

2.3 XX0335在体内抑制A549细胞增殖

与对照组小鼠相比，实验组小鼠在注射XX0335后肿瘤体积明显减小，其生长曲线受到了明显抑制（图4）。

大学生创业团队通常人数较少，对参与成员的综合素质要求较高。校园内创业项目在走向市场化的过程中充满了不确定因素，拥有良好的市场前景和技术优势远远不够。创业团队成员应基本具备企业中不同部门的基本职能，例如财务管理、销售运营、产品设计与售后服务等。

2.4 XX0335诱导肺癌A549细胞凋亡

将A549细胞以2×10/孔的密度均匀铺至12孔板中，待细胞融合度到80%，按实验分组分别加入不同浓度的XX0335。刺激24 h后，每孔加入稀释的EdU溶液（每1 mL 完全培养基中加入EdU 溶液1 μL）1 mL 于37 ℃孵育2 h；随后，PBS清洗3遍，加入150 μL/孔福尔马林固定30 min；吸掉培液，再加入浓度为2 mg/mL的甘氨酸溶液150 μL/孔，室温孵育5 min；PBS清洗3遍，随后加入250 μL/孔的渗透液（0.5%的TritonX100）孵育10min；PBS清洗1遍；加入250μL/孔的染色液（Appollo染色液）室温避光30 min；渗透液清洗3 次，10 min/次；随后用1×DAPI进行细胞核染色30 min，再用PBS清洗2次；最后采用Olympus BX51荧光显微镜观察并拍照。

将A549细胞培养于12孔板中，待细胞融合度达到80%，按实验分组分别加入不同浓度的XX0335，24 h后消化收集细胞。预冷的PBS清洗3遍，加入1×binding buffer重悬，分别加入1 μL的FITC和PI染料染色15 min。流式细胞仪（Beckman cytoflex）上机检测，结果通过系统自带的软件进行分析。

2.5 XX0335对A549细胞周期的影响

XX0335可以剂量依赖性的增加了A549细胞G1期数量，并阻滞A549细胞于G1期（图6）。

2.6 XX0335抑制了A549细胞中的Akt/mTOR信号及凋亡相关蛋白的表达

随着XX0335浓度的升高，p-Akt及p-mTOR的表达量逐渐减少（图7A、B，＜0.05），而Akt和mTOR总蛋白水平没有发生改变。

不同浓度的XX0335刺激A549细胞24 h后，有活性的cleaved PARP表达升高，而Cyclin D11表达量显著降低（图7C、D，＜0.05）。分别对cleaved PARP 和Cyclin D1的蛋白条带进行灰度分析，发现XX0335能诱导凋亡相关蛋白cleaved PARP表达，并能抑制细胞周期蛋白Cyclin D1的表达（图7C、D，＜0.05）。

3 讨论

含氟类化合物具有很好的抗肿瘤活性，目前已经有很多含氟类化合物在临床上用作肿瘤治疗的化疗药物。如2011年在美国上市用作肺癌治疗的克唑替尼，其主要作用机制是抑制酪氨酸激酶受体，且体外实验表明这种药物主要是通过ALK、ROS1和c-Met的磷酸化水平进而抑制肺癌的发展。因此，发现新的具有抗肿瘤活性的含氟类化合物对化疗药物的研发具有重要的意义。XX0335是本研究前期合成的含三氟甲基的新型化合物，其抗肿瘤活性及机制研究还是空白。本研究发现含三氟甲基新型化合物XX0335能够抑制肺癌A549细胞的增殖并诱导凋亡。XX0335刺激后，A549细胞中p-Akt及p-mTOR蛋白水平呈剂量依耐性降低，细胞凋亡蛋白cleaved PARP呈剂量依赖性升高，细胞周期蛋白Cyclin D1呈剂量依耐性降低。且裸鼠荷瘤实验结果表明，XX0335在体内水平抑制了肺癌A549细胞的增殖。这些结果提示XX0335在A549细胞中具有显著的抗肿瘤活性。

对肺癌患者的免疫组化结果分析表明，p-Akt表达水平的升高与肿瘤的发展密切相关。另有研究结果表明，肺癌中p-Akt表达水平升高伴随着p-mTOR蛋白水平的升高，并影响了肺癌细胞的增殖。因此，抑制了肺癌中p-Akt及p-mTOR水平，可能抑制肺癌细胞的增殖进而抑制肺癌的发展。本研究中，XX0335刺激A549细胞24 h后，肺癌细胞的增殖受到明显抑制。通过Western blot实验表明，经过XX0335处理A549细胞后，p-Akt 和p-mTOR 蛋白水平受到抑制，而Akt 和mTOR的总蛋白水平没有发生变化。以上结果表明，XX0335通过抑制Akt和mTOR的磷酸化水平，抑制了A549细胞的增殖。

末级渠系维护养护费用按末级渠系固定资产的1%估算。项目区的固定资产主要包括本次末级渠系工程改造所形成的全部固定资产，也包括过去已登记明细台账的固定资产。过去已建工程的资产需要折算为固定资产净值。根据统计，项目区范围内小型农田水利工程总固定资产为1 338.2万元。根据《水利建设项目经济评价规范》（SL 72—94）， 中小型混凝土防渗渠道、中小型渠系建筑物的折旧年限为30年。采用使用年限法对折旧费用进行计算，得到固定资产净值为1 312.5万元。

聚ADP 核糖聚合酶（PARP）是DNA 修复密切相关的一种酶，其发生切割是细胞发生凋亡的一个重要指标。本研究结果表明，XX0335作用后，cleaved PARP表达量显著增加，表明XX0335诱导了肺癌细胞的凋亡。Cyclin D1参与了细胞周期的调控，影响G1期到S 期转变。在肺癌中该基因的表达异常升高，并影响了肺癌发展和进程。本研究结果显示，XX0335作用后，XX0335可以剂量依赖性的增加G1期的细胞数量，表明XX0335将A549细胞阻滞在G1期。且Cyclin D1的表达量显著下降且呈剂量依赖性，提示该蛋白表达量下降可能抑制了细胞从G1期到S期的转变，进而抑制了细胞增殖并诱导细胞凋亡。

本研究发现XX0335可以有效抑制A549细胞增殖并诱导凋亡，且将细胞阻滞于G1期，并导致PARP发生切割及细胞周期蛋白Cyclin D1表达量下降。同时动物实验也表明XX0335可以抑制肺癌肿瘤的生长，其作用机制与Akt/mTOR 信号通路有关。该发现初步揭示XX0335作为潜在抗肺癌治疗药物的可能作用机制，并为肺癌的临床治疗提供理论及实验依据。但本研究也存在一定的不足，如该新化合物其抗肺癌的活性及详细机制有待进一步阐明，在研究之初无法选择对应的阳性对照药物。需在后续的研究中明确了其具体的抗肺癌作用机制后，选择对应的临床治疗药物作为阳性对照，从而为明确其作为肺癌化疗药物提供实验依据。