自制核心耗材促进大型仪器设备在实验教学中的应用

万 建， 汪 兵， 周 权， 阮 君， 张 迪， 李 兵

（华中师范大学a.生命科学学院；b.湖北省生物学实验教学示范中心；c.国家级生物学虚拟仿真实验教学示范中心，武汉 430079）

0 引 言

大型仪器技术的革新与进步推动着生命科学的高速发展，特别是生命科学进入后基因组学时代，以蛋白组学、代谢组学为代表的组学时代蓬勃发展依赖着高精密仪器设备的革新［1-3］。将前沿生物学研究技术运用到本科生及研究生的培养过程［4］，开阔学生视野，提升专业技能，强化专业学生核心素养的培养，是满足“双一流”人才培养的重要保障［5］。

大型仪器设备高分辨液相色谱质谱联用系统运用到实验教学中，需要解决大型仪器实验耗材昂贵、实验教学与理论教学不匹配、大型仪器设备机时饱满等问题［6］。通过技术攻关自制核心耗材、实验项目构建贴近理论课程需求建立了基于高分辨液相色谱质谱联用技术的蛋白质磷酸化修饰鉴定［7］教学实验流程。同时创新实验教学课堂模式，将大型仪器实验操作融入生物技术创新大实验，以小组的形式开展探究性实验；结合大学生创新创业大赛、大学生实验技能大赛等赛事丰富实验教学模式，让学生真正做到活学活用，提升学生生物专业核心素养。

1 核心耗材自制降低实验教学成本

实验教学项目使用液相色谱为赛默飞的EASYnLC 1200仪器，需要使用毛细管色谱柱完成肽段分离。在实际实验教学过程中，由于学生初次操作，极易因样品制备不纯或样品除盐不彻底而引起色谱柱的堵塞，而目前商业化毛细管色谱柱报价较高，无法在实验教学中广泛运用，故毛细管色谱柱为实验核心耗材。实验教学中心创新使用激光拉针仪和混悬法填柱机自制毛细管色谱柱制备方法（已申请国家发明专利，申请号：201911124668.6），优化毛细管色谱柱制作流程，极大降低实验耗材成本。自制毛细管色谱柱见图1。色谱柱填料C18，3μm，150A，柱尖内径10μm，毛细管内径100μm，毛细管外径360μm，柱长15 cm。

图1 自制毛细管色谱柱实拍图，放大倍数10×

2 贴近理论教学需要构建试验项目

设计蛋白质组学磷酸化修饰位点鉴定实验项目，同时在实验教学设计过程中，融入生物全蛋白提取与鉴定、全蛋白组学定性定量分析等实验内容。由于实验教学项目对实验教学课时有要求，因此本项目优化实验材料与实验流程以及质谱参数设定，单次实验课时可控制在4个学时。同时实验项目的设定紧贴理论课要求，满足人才培养的需要。具体实验流程如下：

2.1 实验材料及设备

12 h复水发菜；C18填料（Agela公司）；乙腈（Fisher公司）；纯水（Fisher公司）；甲酸（Fluka公司）；聚合物微球（自制）；胰蛋白酶（上海生工）；上样缓冲液（Qiagen）；硫酸肽（国药）；洗脱缓冲液（Qiagen）；氯化钠（国药）；双氧水（国药）。

液相质谱联用仪Q-Exactive Plus（ThermoFisher公司）；激光拉针仪（sutter公司）；填柱机（自制），离心机D1008（SCILOGEX公司）；离心浓缩仪（labconco公司）；Proteome Discoverer 2.4 SP1（ThermoFisher公司）；开源蛋白数据库检索网站（http：／／www.uniprot.org／）。

2.2 实验方法

发菜胞内蛋白提取与酶解参照文献［8］的方法进行处理。设置发菜胞内全蛋白磷酸化富集样品组以及发菜胞内全蛋白未磷酸化富集对照组。富集材料使用自制的聚合物微球材料。

（1）富集材料活化。①称量聚合物微球300 mg，硫酸肽固体30 g，加入250 mL烧瓶中，加入150 mL超纯水，超声分散5 min，再用磁力搅拌，室温过夜反应。（此步骤耗时较长，可设置前1天实验课的学生操作留用，且准备部分备用。）②将匀浆好的材料转移到50 mL离心管中，20 000 g离心3～5 min，弃掉上清。③洗涤聚合物微球材料：加入适量0.1%TFA将材料分散，转移到15 mL离心管中震荡洗涤未键合的Ti4＋，15 000 g离心5 min，弃上清，重复5～6次，尽量洗干净Ti4＋。④盐洗。用200 mM NaCl／0.1%TFA水溶液水洗聚合物微球材料一次。⑤水洗。盐洗之后，再用0.1%TFA洗涤2～3次，然后转移到1.5 mL离心管中，15 000 g离心，去掉上清保存。⑥质检。取100 μL最后一次洗涤的上清液，加入到100μL 30%双氧水中，若溶液不变色，呈现无色透明的状态，说明Ti4＋已经洗净，若溶液变色，则继续洗涤。取少量材料，加入到100μL 30%双氧水中，若溶液变成明显的黄色，则说明材料螯合成功。

（2）磷酸化蛋白富集。①蛋白酶解液与上样缓冲液按体积比1∶1混合均匀，然后按材料∶蛋白＝25∶1（m／m）加入聚合物微球材料，室温1 500 g震荡材料30 min，15 000 g离心5 min，弃掉上清液。②加入100μL水溶液重悬，1 500 g震荡30 min，15 000 g离心5 min，弃上清。③离心后的材料中，加入100μL水溶液重悬，1 500 g震荡30 min，15 000 g离心5 min，弃上清。④沉淀中加入150μL洗脱缓冲液，震荡15 min，冰浴超声15 min，20 000 g离心5 min，收集上清；加入少量洗脱缓冲液，震荡5 min。20 000 g离心5 min，收集上清，合并2次上清，20 000 g离心5 min，将上清移至新管。⑤离心浓缩样品，加水溶解后上质谱检测。

2.3 色谱分离

流动相。A相为0.1%的甲酸水溶液，加5%乙腈；B相为90%的乙腈水溶液，加0.1%甲酸［9］。流速为500 nL／min，洗脱梯度见表1。进样量为1μL。

表1 色谱洗脱梯度

2.4 质谱检测

质谱采用质谱仪Q-Exactive Plus仪器，离子源为HESI。主要质谱采集数据参数：采集模式为正离子模式：离子源电压设为2.2 kV；质谱采集设置：一级采集分子量范围：350～2 000 m/z；最大离子注入时间20 ms；分辨率70 000；二级质谱最大离子注入时间50 ms；采集分辨率17 500；TopN设定为20；碎裂能量27 eV［10］。

2.5 生物信息学分析

将实验组和对照组数据导入到配套数据处理软件Proteome Discoverer 2.1 SP1中，在开源蛋白数据库网站Uniport（http：／／www.uniprot.org／）下载发菜蛋白库，导入数据处理软件［11］。

2组数据使用同一检索条件，检索条件设置如下：比对数据库勾选导入的发菜全蛋白数据库；比对多肽质量范围350～5 000Da；信噪比（S/N）＞1.5；母离子误差＜10×10－6；多肽片段误差＜0.2Da；多肽片段中氨基酸个数范围6-144；肽段可变修饰选择磷酸化修饰，修饰位点选择S（丝氨酸）T（苏氨酸）Y（酪氨酸）3个位点。正反数据库比对检验阈值，显著0.05，极显著0.01。

2.6 结果分析

2.6.1 质谱谱图分析

本次实验组与数据库匹配谱图31 593个，得到肽段2 472条，最终定位得到840个发菜蛋白。对照组匹配35 986个数据库谱图，得到3 108条肽段，定位得到1 028个发菜蛋白。实验组鉴定到蛋白数目小于对照组，分析判断磷酸化富集过程可能会带来一定数量的蛋白丢失。

2.6.2 磷酸化蛋白鉴定与分析

实验组共鉴定到磷酸化蛋白质95个，磷酸化肽段112个及磷酸化位点217个，对照组未鉴定到磷酸化修饰。数据中分析得到肽段：KPEDTAIHNK在实验组和对照组均被鉴定，检索结果显示肽段在T（苏氨酸）位点有磷酸化修饰，见图2。

图2 磷酸化蛋白质Nfla＿6602富集后与富集前的谱图

2.6.3 实验项目处理

由于本实验项目用到液相色谱质谱联用仪为大型仪器设备，台套数有限，故实验小组设置4人一组，每个实验组独立完成一次本次实验。实验设置实验组和对照组，实验项目完成后，实验小组可对本实验小组数据进行分析，同时要求和其他实验小组数据进行比对分析，比较蛋白样品富集效率完成实验数据分析。实验小组可根据小组数据对磷酸化位点进行分析，可扩展分析该蛋白的生物学功能，并完成实验报告。

3 创新实验课题丰富实验教学模式

大型仪器设备需要承担大量的科研任务，而实验教学作为一项教学任务需要在规定的课时内完成实验教学项目。因此本实验教学项目创新教学模式，将实验项目融入学院特色的生物技术大实验中，学生根据自己的兴趣选择实验项目，并以3～5人的小组形式开展实验，灵活安排实验进度，方便协调高分辨质谱仪科研与实验教学机时。同时实验中心积极鼓励学生参加大学生创新创业大赛、大学生实验技能大赛等比赛，鼓励学生在参赛项目中运用本实验教学项目，以赛促学，促进学生对实验教学项目更深层次的理解。

4 结 语

生命科学的发展离不开实验技术与方法的革新［12］。将前沿生物实验技术应用到本科实验教学中有利于提高学生对生命科学的认知［13］，同时开阔学生视野［14］。但是大型仪器设备由于台套数少、实验样品前处理复杂、实验耗材昂贵、仪器机时饱满、实验教学项目与理论课程不匹配等因素限制了其在实验教学中的应用［15］。通过自制毛细管色谱柱降低实验项目耗材价格，优化实验步骤选取合适实验材料，探索一套适合本科实验教学的蛋白组学磷酸化富集实验项目。

该项目以创新实验课程在研究生实验教学中开展，受到师生的一致好评。实验教学项目自开设以来，参与本科生毕业论文8篇，支撑大学生创新创业大赛等赛事奖项13项，指导教师奖项2项。中心将进一步优化实验流程以及耗材准备，将更多的大型仪器推广到实验教学，为一流人才的培养贡献力量。