褐边绿刺蛾幼虫刺毛结构及蛰伤机制初探

杨乐乐，段琛媛，李 晶，孟凡华，曹 瑛，代先东，张爱兵*，范崇旭*

(1. 军事科学院防化研究院，北京 102205；2. 首都师范大学生命科学学院，北京 100048)

鳞翅目Lepidoptera为昆虫纲Insecta第二大目，我国鳞翅目昆虫物种资源丰富，鳞翅目幼虫(俗称：毛虫)不仅是重要的农林叶害虫，同时部分鳞翅目幼虫由于其体表分布含有毒素的体刺或刚毛而对人类健康造成影响(李朝品等, 1999; Seldeslachtsetal., 2020)。近年来，伴随我国农业产业结构的调整，经济林木和城市绿化林木种植面积不断扩大，造成以该类植物为重要寄主植物的鳞翅目幼虫与人类的接触机会增加，人类皮肤接触毛虫刺毛而造成的皮炎等问题频发，其中以刺蛾科Limacodidae幼虫造成的过敏性皮炎最为常见(韩方岸等, 2005)。刺蛾科昆虫是重要的植食性害虫，在全球范围内广泛分布，共有301属，1 600余种，在我国分布的有200余种(武春生, 2010; van Nieukerkenetal., 2011; 焦萌等, 2019)。由于刺蛾科幼虫生长周期较长(一般为6～8龄)，易受到鸟类等捕食者的攻击。因此其演化出伪装、警戒色、有毒刺毛等多种防御策略(Greeneyetal., 2012)。其中有毒刺毛既是刺蛾科幼虫有力的防御武器，也可作为重要的形态分类依据。

褐边绿刺蛾ParasaconsociaWalker是我国华北及华中地区最为常见的刺蛾科昆虫。其幼虫颜色鲜艳，一般呈蛞蝓型，有许多枝刺和毒毛，因此也被称为杨剌子(王凤等, 2006)。寄主植物以蔷薇科果树、农作物叶子为主，是华北地区重要的经济林业害虫之一。当人接触到幼虫枝刺和毒毛时会造成蛰伤，症状包括瘙痒、刺痛、丘疹、红肿、皮炎等。虽然大多数刺蛾科幼虫体表具有枝刺和毒毛，但不同物种在刺毛结构、着生部位以及毒素成分等方面存在一定差异(Hossler, 2009)。目前对于鳞翅目幼虫体表形态特征的研究较少，因此本研究以褐边绿刺蛾幼虫为研究对象，对其体表的枝刺和毒毛形态结构进行分析，明确其毒素储存部位。同时，对其毒素化学成分进行了研究，并对蛰伤机制进行初步探讨。这一研究对于今后探究鳞翅目幼虫的防御机制和人类社会公共健康提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 幼虫采集

利用震布法在河北省沧州市南大港湿地自然保护区(38.35°N，117.15°E)采集褐边绿刺蛾幼虫约600头，放置于冻存管中带回实验室进行保存。

1.2 利用扫描电镜进行体表毒毛形态分析

挑选末龄幼虫在体视显微镜下观察其体表枝刺和毒毛形态，将体表刺毛按照表型进行初步分类。用解剖剪将幼虫背部第三簇(由头部向尾部方向)簇状枝刺、侧部带有橘色末端刺团状枝刺以及尾部带有黑色修饰刚毛的刺团取下后，置于2.5%戊二醛固定液中常温固定4 h。之后用0.1 mol/L PBS缓冲液漂洗3次(15 min/次)，随后用1%锇酸-0.1 mol/L PBS固定液再次进行固定(30 min)，然后用0.1 mol/L PBS缓冲液进行漂洗。接着依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%的酒精脱水，每次15 min。再加入乙酸异戊酯置换10～20 min，随后进行临界点干燥。最后将处理后样品组织用导电胶粘贴在标本台上(观察面朝上)，喷金后利用扫描电镜(HITACHI U8010)进行观察拍照。

1.3 刺毛组织切片

为进一步研究褐边绿刺蛾幼虫体表体刺的结构，利用组织切片技术对其结构进行研究。用解剖剪分别取下幼虫背部整簇体刺和尾部整个刚毛团，用75%酒精进行清洗后投入到4%多聚甲醛中固定24～48 h，即可进行石蜡包埋操作。然后进行石蜡切片，并将切片利用苏木精-伊红染色(HE染色)法进行染色。制作完成后的切片使用全景扫描仪(3D HISTECH Pannoramic MIDI)进行拍照观察。

1.4 幼虫修饰刚毛和体刺粗毒素提取

为了研究褐边绿刺蛾修饰刚毛和体刺中毒液的成分，进行了粗毒素的提取。选取200头幼虫进行研究，将其体表体刺和修饰刚毛取下后分别放入液氮中冷冻5 min后，转移至研钵中进行研磨。研磨后所得粉末转移至离心管中，加入20 mL浓度为0.1%乙酸水溶液进行超声震荡20 min，产物利用冷冻离心机在4℃下10 000 g离心10 min，收集上清液；残渣重复上述操作2次，合并上清液并进行冷冻干燥后得到体刺和修饰刚毛的粗毒素提取物。

1.5 小鼠致痛活性实验

本研究采用小鼠舔爪实验模型进行致痛活性评价实验(Yaoetal., 2019)，实验小鼠选用23～25 g雄性C57BL/6J品系小鼠。将修饰刚毛和体刺粗毒素提取物分别配制成浓度0.1 mg/mL的溶液，采用生理盐水作为空白对照组，500 mM辣椒素溶液作为阳性对照组。将所得的粗毒素提取物稀释液和对照样品分别取10 μL从足底皮下各注射3只实验小鼠右后爪，观察并记录小鼠反应。

1.6 毒液化学成分分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)技术进行毒液化学成分分析(Sambrooketal., 1989)。使用上样缓冲液分别将修饰刚毛提取物和体刺提取物配制成不同浓度溶液(8 mg/mL、5 mg/mL、2 mg/mL)，于沸水中加热3 min后进行10 000 g离心，取8 μL上清液进行SDS-PAGE检测(分离胶浓度15%)，电泳结束后使用考马斯亮蓝快速染液对凝胶进行染色并拍照。

2 结果与分析

2.1 刺毛结构与形态

褐边绿刺蛾末龄幼虫体长约20～25 mm，体表布有40簇绿色丛状体刺(图1-a)，其中背部两列各10簇；双侧各一列10簇。背部两列靠近头部的第3簇和靠近尾部的第2簇体型稍大，其余相差不大。每簇刺丛有20～35根体刺(图1-b)。体刺长约2 mm，直径100～150 μm，刺尖呈棕黑色，刺身呈绿色，刺尖与刺身之间具有明显边界(图1-b)。背部两列体刺从头部第3簇至尾部第10簇，在外皮凸起的最顶部长有至少1枝没有明显尖端的棒状体刺(图1-c)，其远体端呈棕黑色，有圆形开口，偶见液体分泌物排出。体侧两列体刺从头部第3簇至尾部第10簇，在外皮凸起的顶部长有1枚

图1 褐边绿刺蛾幼虫及刺毛Fig.1 Larva and urticating hairs of Parasa consocia注：a，褐边绿刺蛾幼虫；b，体刺；c，棒状刺；d和e，橘黄色刺团；f，微球刺；g，黑色刚毛团；h，修饰刚毛及其底部；i，茧。Note: a, Larva; b, Spines; c, Rod-like spines; d and e, Orange hairs; f, Microspheric setae; g, Black modified setae; h, Modified seta and base of modified seta; i, Cocoon.

橘黄色橄榄状的刺团(图1-d, e)，刺团长径约750 μm，短径约380 μm，刺团表面附着一层橘黄色微球刺(图1-f)，微球刺直径约20 μm，表面长满小刺，刺长15～20 μm，每个微球刺有1根主刺，刺长约25 μm。微球刺触碰易脱落，脱落后暴露出内部的外皮凸起。据估算每个刺团表面覆有约300个微球刺，每头幼虫共有16个刺团，估算约为4 800个微球刺(图1-f)。此外，幼虫尾部长有4团黑色刚毛(图1-g)，这种刚毛属于修饰刚毛，长约700 μm，直径约30 μm，刚毛通体长有倒刺，底部有3～5个似支架的倒刺(图1-h)，底部中心有一个小凸起与外皮相连，黑色刚毛触碰易脱落。根据组织切片估计刚毛的密度约为300根/mm2，每团黑色刚毛半径约1 mm，因此每头幼虫长有3 500～4 000根黑色刚毛。在结茧时，修饰刚毛会被留在茧表面(图1-i)。

扫描电镜结果显示，褐边绿刺蛾体表体刺由刺身和刺尖两部分组成(图2-a, b, c)，刺身和刺尖连接处呈环状。开口的棒状体刺顶端平齐，上小下大，上部开口有填充物(图2-d)。微球刺表面均匀分布约60根刺，刺长15～20 μm不等，除此之外，微球刺长有一根主刺，主刺与球状刺身连接处呈环状。微球刺脱落后的虫体部位存在明显凸起(图2-e, f)，该凸起应该与微球刺某个部位连接。尾部的修饰刚毛表面可见明显倒刺，并未发现表面存在开口。修饰刚毛(图2-g)是由底部中心的凸起与虫体相连，当修饰刚毛脱落后，虫体与其连接处出现明显的小洞(图2-h, i)。

图2 褐边绿刺蛾幼虫刺毛电镜照片Fig.2 Photos of urticating hairs of Parasa consocia larva by scanning electron microscope注：a，体刺及棒状刺；b，体刺；c，体刺的尖端；d，棒状刺；e和f，微球刺；g，黑色刚毛团；h，修饰刚毛；i，修饰刚毛的近体端与虫体连接处。Note: a, Spines and rod-like spines; b, Spines; c, Spine tip; d, Rod-like spines; e and f, Microspheric setae; g, Black setae; h, Modified setae; i, Joint of the proximal end of modified setae and integument.

组织切片结果表明，体刺、微球刺和修饰刚毛均为中空结构(图3-a, c, d)，且均有内容物填充，其中体刺刺壁较厚(图3-a, b)，约7～9 μm。修饰刚毛经HE染色结果表明刺壁可分为内外两部分(图3-d)，其中外壁染色为黑色，内壁为黄褐色。

图3 褐边绿刺蛾幼虫刺毛切片图片Fig.3 Section of urticating hairs stained with hematoxylin-eosin of Parasa consocia larva注：a，体刺横切图；b，体刺纵切图；c，微球刺；d，修饰刚毛横切图。Note: a, Cross section of spines; b, Longitudinal section of spines; c, Microspheric setae; d, Cross section of modified setae.

2.2 毒素的提取

将200头褐边绿刺蛾幼虫体表的修饰刚毛与体刺中的粗毒素用0.1%醋酸水溶液进行提取，冷冻干燥后共得到体刺提取物约79 mg和修饰刚毛提取物约39 mg。

2.3 致痛活性评价

为了验证体刺与修饰刚毛提取物是否具有致痛活性，在C57BL/6J品系小鼠的右后足底部注射10 μL体刺或修饰刚毛提取物溶液，每组进行3次平行实验，观察并记录小鼠反应情况。当浓度为0.1 mg/mL时，体刺及修饰刚毛提取物溶液使小鼠表现出相似的症状，受试小鼠均很快出现舔爪行为，在1 h的观察时间内该症状未消失。当浓度为1 mg/mL时，体刺及修饰刚毛提取物溶液使小鼠表现出不同的症状。体刺提取物溶液仅使受试小鼠出现舔爪行为，频率较上一实验组明显提高。修饰刚毛提取物溶液使受试小鼠在前20 min症状与体刺提取物类似，约20 min小鼠开始出现频繁的扭体现象，运动活力下降，舔爪频率降低。30 min左右小鼠口鼻开始出现分泌物，并逐渐增多。40 min小鼠眼部出现白色分泌物，并很快覆盖眼球。在1 h观察时间结束时，上述症状均未缓解。次日，小鼠基本恢复正常。

2.4 毒素成分研究

为进一步探究两种提取物中活性成分的组成，对不同浓度的体刺和修饰刚毛提取物进行SDS-PAGE电泳分析(图4)。结果表明两种提取物均含有蛋白质和多肽，体刺提取物中蛋白分子量分布更广，且总数量多于修饰刚毛提取物。修饰刚毛提取物中蛋白分子量主要分布在25 kDa以下，但在20 kDa、14 kDa附近，以及6.5 kDa以下条带明显与体刺提取物有区别。

图4 褐边绿刺蛾幼虫体刺和修饰刚毛提取物SDS-PAGE电泳图Fig.4 Spines and modified setae extract of Parasa consocia larva monitored by SDS-PAGE注：第1和第8泳道，混合蛋白标准液；第2～4泳道，体刺提取物溶液(浓度分别为8，5，2 mg/mL)；第5～7泳道，修饰刚毛提取物溶液(浓度分别为8，5，2 mg/mL)。Note: Lane 1 and lane 8, Premixed protein marker; lane 2～4, Spines extract solution (concentration: 8, 5 and 2 mg/mL); lane 5～7, Modified setae extract solution (concentration: 8, 5 and 2 mg/mL).

3 结论与讨论

目前对于鳞翅目成虫的研究较多，对幼虫的研究主要集中在种类描述阶段，对于其生物学特征的研究较少(James, 2017)。国内关于毛虫的出版物，最全面的就是由朱弘复等编著、科学出版社出版的《蛾类幼虫图册》(一)，共计述了210种毛虫，隶属15科(朱弘复等, 1979)。国外对于鳞翅目幼虫的研究相对较早，英国学者Hinton对鳞翅目幼虫刚毛的同源性进行了研究(Hinton, 1946)，日本的一色周知等和白水隆等编著了日本鳞翅目幼虫图鉴(一色周知等, 1977; 白水隆和原章, 1979)。

对于鳞翅目幼虫有毒刺毛的研究，Gilmer将具有刺激性的刺毛分为毛(hair)和体刺(spine)两类，进而又将每类分为两个亚型(Gilmer, 1925)。Maschwitz等将所有的刺毛分为4类(Maschwitz and Kloft, 1971)，分别为：普通毛、远端结构特殊的刺激性毛、以尖端为基部的刺激性毛以及有毒体刺。Kawamoto等对鳞翅目幼虫体表刺毛的结构开展了研究，并对刺激性刺毛进行了初步分类(Kawamoto and Kumada, 1984)，将刺激性毛分成了两大类11型，其中一类为针毛(spicule)7型、另一类为体刺(spine)4型。Battisti等在总结前人分类的基础上，将刺激性刺毛大致分为三类(Battistietal., 2011)，分别为真刚毛(true seta)、修饰刚毛(modified seta)和体刺(spine)。真刚毛长度大约在100～500 μm左右，直径3～7 μm，表面长有倒刺，尖端插在幼虫体表的凹槽内，极易从虫体脱落，一般在虫体密度可到达10 000～12 000根/mm2。修饰刚毛长度一般比真刚毛长(<1 mm)，表面长有倒刺，尖端朝外，粗的底部与虫体相连，受到刺激后易脱落，与真刚毛相比，其密度要小得多。体刺包含多种特殊的细胞，具有分泌功能。从外形来看体刺由两部分组成，分别是刺尖和刺身。刺身坚硬不易破裂，刺尖尖锐易破裂。体刺内部具有中空结构，充满分泌物。刺入皮肤后刺尖破裂，刺身中的内容物(毒液)会流出，造成不良反应。本文在研究中采用了该分类方法。

褐边绿刺蛾幼虫体表4种不同形态的刺毛中2种为体刺，图1-b是普通体刺，与其它种类毛虫的体刺结构类似，只是尺寸上的差异；而顶端开口的棒状体刺(图1-d)则不多见。Kawamoto曾研究过褐边绿刺蛾幼虫的刺毛，但没有提到这种结构的体刺，只描述了普通体刺，而且强调体刺没有开口(Kawamoto, 1978)。Maschwitz在刺毛分类中提到过Megalopygeoperculari和Automerisio幼虫长有类似的体刺，毒液可以从棒状体刺顶端的开口处排出(Maschwitz and Kloft, 1971)。褐边绿刺蛾的刚毛为典型的修饰刚毛，通体长有倒刺，尖部在远体端，易脱落。另一种是微球刺(microspheric setae)，这是笔者给出的命名。Kawamoto等在分类中提到类似的刺毛，称作星形毛(star-like hair)，将其分类为针毛5型，既没有说明大小尺寸，也没有给出种属来源，无法判断是否与本文观察到的微球刺为相同的刺毛(Kawamoto and Kumada, 1984)。他在研究褐边绿刺蛾时也没有指出这种刺毛(Kawamoto, 1978)。Maschwitz在综述中描述刺蛾科幼虫长有这种刺毛(Maschwitz and Kloft, 1971)，由于和体刺长在一起，所以没有单独分类，而是放在有毒体刺中一起描述。笔者认为这种微球刺应该属于刚毛的一种，至于它属于真刚毛还是修饰刚毛需要进一步确定。

像褐边绿刺蛾幼虫长有4种结构刺毛的情况还未见文献报道。刺蛾科幼虫通常长有1～2种不同结构的刺毛。比如黄刺蛾Cnidocampaflavescens、扁刺蛾Thoseasinensis幼虫只有1种体刺；多数绿刺蛾属幼虫长有1种体刺和1种刚毛。褐边绿刺蛾幼虫的4种刺毛在大小尺寸和数量上存在很大差异。体刺长度约2 mm，基部直径150 μm，总数约1 200根，其中开口的棒状体刺更粗壮，只有20余根；修饰刚毛长度约700 μm，直径约30 μm，总数约4 000根；而微球刺直径约为20 μm，总数约4 800个。推测不同的刺毛可以产生协同的作用。普通体刺通过刺入皮肤释放毒液，开口的棒状体刺只要轻微的接触就能沾染毒液；修饰刚毛长有倒刺，内部含有毒液，刺入皮肤产生机械伤害的同时还能产生化学伤害。修饰刚毛在脱落离开虫体后很长一段时间仍具有伤害能力，这可以解释为什么幼虫在死后仍具有蛰伤能力。而且，在脱落的修饰刚毛能到达的地方都存在蛰伤的可能。幼虫结茧时，修饰刚毛会被转移到茧的表面起到保护作用(图1-i)；而微球刺特别容易脱落，对于捕食者的眼睛等敏感部位能够产生伤害。至于尺寸上的巨大差异，可能是用来抵御不同体型的捕食者。总之，褐边绿刺蛾幼虫4种结构的刺毛，能产生沾染、刺入注射、携带刺入三种毒液的施用模式，形成协同的伤害模式。

两种刺毛毒素成分的初步研究表明，褐边绿刺蛾幼虫的体刺和修饰刚毛都含有毒素，能引起小鼠舔爪、过敏等症状。初步的成分分析显示产生致痛作用的主要化学成分是蛋白质和多肽，这与最近关于鳞翅目幼虫有毒刺毛成分研究的结果是一致的(Mitpuangchonetal., 2021; Walkeretal., 2021)。两种刺毛的化学成分和生物活性存在一定的差异，可能是因为两种刺毛的使用方式不同，需要有不同毒素进行协同作用；也可能是因为体刺中存在上皮细胞或血淋巴，其毒液成分中可能含有一些虫体正常代谢产生的蛋白质等成分(Spadacci-Morenaetal., 2016)，这需要进一步的实验证据。

对于刺蛾科幼虫刺毛防御策略的了解，有助于我们应对和处理其造成的伤害。目前，对于刺蛾科幼虫蜇伤事件通常采用的处理方法较为简单，一般是将偏碱性的液体抹于患处，以缓解患处疼痛。这对于由修饰刚毛引起的机械性疼痛并无作用，并且反复接触患处可能会加重修饰刚毛带来的不良反应。对于褐边绿刺蛾幼虫蛰伤，首先使用胶带将患处残留的体刺尖端及刚毛粘下，再进行对症治疗。

本研究初步探讨了褐边绿刺蛾幼虫的刺毛结构和蜇伤机制，对毒液中的具体活性成分还有待进一步研究，进而从分子水平阐述毒液的伤害机制。