湿热型糖稳态失衡患者的肠道菌群特征变化研究

黄佳梅，黄 菲

(1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023；2. 南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州 215009；3. 苏州市吴门医派研究院，江苏 苏州 215009)

糖尿病是常见多发病，截止到2017年，我国18岁及以上人群糖尿病患病率达到了11.2%，其中2型糖尿病(T2DM)占90%以上[1]，大部分属于湿热证型[2]。糖尿病的高患病率与致死、致残率给医疗保健部门带来了巨大的经济负担，同时也严重影响国民健康及平均寿命[3]，因此做好糖尿病的防治工作具有重要的意义。早期干预，特别是对糖尿病前期及早期患者进行有效控制有助于降低糖尿病及其相关并发症的发病率[4]。肠道菌群作为人体的内在环境因子，它在调节新陈代谢、免疫力、炎症和其他生理和病理过程中起着至关重要的作用。最近的证据表明，肠道菌群的失调可以影响宿主的肥胖、胰岛素抵抗和激素分泌，共同影响T2DM的进展，它们具有作为预防T2DM发生以及延缓T2DM进展的新药靶标的潜力[5]。因此本研究通过肠道菌群细菌16S rRNA的V3～V4区域的高通量测序，探讨湿热型人群的糖代谢水平与肠道菌群的关系，阐述不同糖代谢状态湿热型患者的菌群多样性特征，以期为临床基于肠道菌群靶点有效干预T2DM的防治提供客观依据。

1 资料与方法

1.1西医糖代谢状态分类诊断标准 参考《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)(上)》[1]：空腹血糖<6.1 mmol/L、餐后2 h血糖<7.8 mmol/L为正常血糖；空腹血糖6.1～7 mmol/L、餐后2 h血糖<7.8 mmol/L为空腹血糖受损；空腹血糖<7 mmol/L、餐后2 h血糖在7.8～11.1 mmol/L为糖耐量减低；空腹血糖≥7 mmol/L、餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L为糖尿病。其中空腹血糖受损和糖耐量减低统称为糖调节受损，也称糖尿病前期。

1.2中医湿热证诊断标准 参照《中药新药临床研究指导原则(试行)》[6]，主症：口渴，易饥，四肢倦怠，大便溏而不爽或大便秘结。兼症：形体肥胖；心胸烦闷，小便黄赤；口苦；腹胀满。舌脉：舌体胖大、边有齿痕，舌质红、苔黄腻，脉濡数或滑数。符合以上主症2项，或主症1项、兼症2项，并结合舌象脉象即可诊断。

1.3纳入标准 ①符合上述糖代谢状态分类诊断标准及中医湿热证诊断标准；②年龄25～70岁(含)，性别不限；③早期T2DM病程≤2年；④受试者对本研究知情，并签署知情同意书。

1.4排除标准 ①不符合上述纳入标准者；②正在使用对血糖有影响的药物者；③近1个月内服用过抗生素及微生态制剂者； ④1型糖尿病和特殊类型糖尿病者；⑤存在重大创伤、手术、应激、感染、胃肠道手术史等情况者；⑥妊娠或哺乳期妇女；⑦合并其他严重原发疾病或精神疾病者；⑧有长期慢性腹泻史，或近1个月内有腹泻病或其他胃肠道疾病史者；⑨研究者认为有不适宜参与本次研究的其他情况者。

1.5一般资料 选择2021年4—12月在苏州市中医医院内分泌科门诊就诊及苏州市高新区横塘人民医院、苏州市沧浪新城社区卫生服务中心体检的湿热型人群100例，其中男40例，女60例，年龄(64.6±7.6)岁。

1.6研究方法 根据糖代谢水平将入选者分为健康组41例、糖尿病前期组38例、糖尿病早期组21例。收集3组人口学资料[性别、年龄、身高、体重、腰围、体质指数(BMI)]、临床代谢检测指标[空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR，HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，由苏州市中医医院检验科与横塘人民医院检验科完成]；采集患者的粪便，采用16S rRNA高通量测序方法进行生物信息学分析，制作Alpha多样性指数柱状图，利用SPSS 22.0软件分析菌群差异。

1.6.1粪便样品采集、DNA抽提和检测方法 检查前1 d禁酒及药物，检查前8 h禁食。7:00按照微基生物科技(上海)有限公司提供的粪便采集盒(专利号：ZL 2016 2 1208783.3)说明书采集粪便样本。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)，严格按照说明书步骤提取样本中微生物DNA。利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性。

1.6.216S rRNA序列扩增和MiSeq测序方法 参考文献[7-8]方法,选取16S rRNA的V3～V4区序列进行高通量测序分析。首先将纯化的DNA作为模板，利用16S rRNA V3～V4区通用引物(357F 5’-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3’和806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)PCR扩增目的片段16S rDNA V3～V4区，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测效果较好的样本于2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收,而后将回收产物作为模板进行二次PCR扩增，将Illumina平台测序所需要的接头、测序引物、标签序列添加到目的片段两端。全部PCR产物采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)进行回收，并用FTC-3000TMreal-time PCR仪进行qPCR定量，均一化混匀后完成文库构建，然后在Illumina MiSeq 2×300 bp平台上完成测序。第一次PCR扩增体系：5×Buffer 10 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶1 IU，F/R内侧引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 5～50 ng，补充超纯水至50 μL。PCR扩增条件为94 ℃ 2 min；24个循环(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min，10 ℃保温。第二次PCR扩增体系：5xBuffer 8 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶0.8 IU，F/R外侧引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 5 μL，补充超纯水至40 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 2 min；8个循环(94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min，10 ℃保温。

1.6.3生物信息分析方法 对测得的原始数据通过barcode分配样品reads，得到每个样本的有效序列，采用Trimmomatic软件，去掉测序结果末端低质量的序列，根据PEreads之间的overlap关系，采用flash软件将成对的reads拼接成一条序列，同时采用mothur软件对序列质量进行质控和过滤，去除模糊碱基、单碱基高重复区、过长和过短的序列以及PCR过程中产生的一些嵌合体，得到优化序列后进行OTU聚类(UPARSE software)，OTU代表序列与gold database(v20110519)数据库比对进行物种信息注释。基于OUT聚类分析结果，对OUT进行多种多样性指数分析(即Alpha多样性分析)及对测序深度的检测，并绘制花瓣图；基于物种分类学信息，在门、纲、目、科、属水平上利用SPSS 22.0软件对3组数据进行统计学分析，选择差异显著(即P<0.05)的物种用柱形图展示出来，以行可视化分析。

2 结 果

2.1人口学资料及临床代谢指标比较 3组性别、年龄、腰围、TC和LDL-C水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；糖尿病前期组和糖尿病早期组的BMI、HOMA-IR、TG水平均明显高于健康组(P均<0.05)，HDL-C水平均明显低于健康组(P均<0.05)，糖尿病前期组的HOMA-IR明显高于糖尿病早期组(P<0.05)。见表1。

表1 湿热型不同糖代谢状态者人口学资料及临床代谢指标比较

2.2肠道菌群测序序列及稀释性曲线分析 测序数据经优化后共获得6073681条有效序列。基于OUT聚类结果的稀释性曲线随样本序列数目增加趋于平坦(见图1)，提示测序深度合理。

图1 湿热型不同糖代谢状态者粪便样本肠道菌群测序OUT水平稀释性曲线

2.3肠道菌群测序Alpha多样性分析 健康组chao指数和ace指数均高于糖尿病前期组和糖尿病早期组，其中健康组与糖尿病前期组比较差异有统计学意义(P<0.05)；3组间shannon指数和simpson指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，但是3组中健康组shannon指数最高、simpson指数最低。见图2。

图2 湿热型不同糖代谢状态者粪便样本肠道菌群测序Alpha多样性分析

2.4肠道菌群测序肠道菌群群落差异分析 在门水平上，糖尿病前期组、糖尿病早期组的Bacteroidetes(拟杆菌门)丰度均明显高于健康组(P均<0.05)；在属水平上，糖尿病前期组及糖尿病早期组的Blautia、Gemella丰度均明显低于健康组(P均<

0.05)，糖尿病前期组与糖尿病早期组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；糖尿病前期组及糖尿病早期组的Acinetobacter(不动杆菌)、Oscillospira(颤螺旋菌属)、Anoxybacillus(厌氧芽孢杆菌属)丰度均明显高于健康组(P均<0.05)，且糖尿病早期组均明显高于糖尿病前期组(P均<0.05)。其他分类水平上，3组Erysipelas(丹毒丝菌)丰度在纲、目、科三个分类水平上差异均有统计学意义(P均<0.05)，以健康组的丰度值最高；糖尿病早期组Pseudomonadales(假单胞菌目)、Moraxellaceae(莫拉菌科)的丰度明显高于糖尿病前期组和健康组(P均<0.05)，糖尿病前期及糖尿病早期组Lachnospiraceae(毛螺菌科)的丰度均明显低于健康组(P均<0.05)。图3～5。

图3 门水平湿热型不同糖代谢状态者差异物种丰度

图4 属水平湿热型不同糖代谢状态者间差异物种丰度

图5 纲、目、科水平湿热型不同糖代谢状态者差异物种丰度

3 讨 论

T2DM属于中医学“消渴病”范畴，以往主要包括肺热伤津证、胃热炽盛证、气阴两虚证、肾阴亏虚证、阴阳两虚证这5种证型[9]。《景岳全书》云：“消渴病，其为病之肇端，皆高粱肥甘之变、酒色劳伤之过，皆富贵人病之而贫贱者少也。”由此可见，消渴病的发生多与过食肥甘及醇酒厚味密切相关，现代人由于生活水平与经济能力的提高，更多地形成了日常膏粱厚味的饮食模式，此类食品多滋腻碍胃，损伤脾胃运化，致湿热内蕴，发为“脾瘅”[10]。久则脾土转输失职，胃虽受谷，不能运化精微，聚而不散，隧道壅塞，清浊相混，湿郁于热，热又生湿，湿热相合为病，终致消渴[11]。故而在现代社会环境背景下，湿热病机贯穿T2DM的发生发展过程，是糖稳态早期失衡的常见及主流病因，并且目前已有多项研究证实湿热证型已经成为当前T2DM患者最常见的中医证型[12-14]。因此本研究以湿热证型人群作为研究对象，研究T2DM早期发生发展的影响因素，希望可以借此制定出更合适现代糖尿病人群的预防治疗对策。

本研究发现，湿热型糖尿病前期和糖尿病早期患者的BMI均显著高于健康人，且超出正常范围，说明湿热加肥胖患者属于糖尿病的好发人群,管理好自身的体重对于预防糖尿病的发生具有重要意义；糖尿病前期和糖尿病早期患者的HOMA-IR均明显高于健康人，符合T2DM多由胰岛素抵抗发展而来的机制。本研中糖尿病前期患者的HOMA-IR明显高于糖尿病早期患者，一方面是因为糖稳态早期失衡时，机体通过胰岛素抵抗来调动胰岛素分泌潜能来维持血糖的稳态，另一方面也与现代人们对于健康越来越重视有关，随着大众体检频率的增加，以及基层糖尿病宣教工作的大量开展，使得糖尿病的确诊时间不断向前推移，已经被确诊的早期T2DM群体往往会预先注意控制饮食以及适当加强锻炼，健康的生活方式可以使他们在适当减重的同时改善胰岛素抵抗的情况[15]。关于血脂方面，本研究发现糖尿病前期和糖尿病早期患者较健康人具有更高水平的TG以及更低水平的HDL-C，证实了糖脂代谢紊乱是相辅相成、互相影响的。

以往对T2DM研究的重点是宿主代谢和激素作用，而新出现的证据表明肠道微生物组即定植于胃肠道的共生微生物，在T2DM发病机制中也起着重要作用[5]。事实上，肠道微生物的变化可能代表了那些有T2DM风险或患有T2DM的人尚未开发的治疗靶点。因此本研究采用肠道菌群高通量测序技术，探讨湿热体质人群不同糖代谢水平与肠道菌群的关系。Alpha多样性分析是反映每组样品内的物种菌群丰富度和均匀性的一种分析方法，其中chao指数和ace指数反映物种丰富度，shannon指数和simpson指数反映菌群多样性和均匀度[16]。本研究Alpha多样性分析证实，与健康人相比，糖尿病前期及糖尿病早期患者的肠道菌群丰度较健康人低；3组中物种丰度显著上调的菌有6个，分别为拟杆菌门、不动杆菌属、颤螺旋菌属、厌氧芽孢杆菌属、假单胞菌目、莫拉菌科；丰度显著下调的菌也有6个，分别为Blautia、Gemella、Erysipelas(纲、目、科)、毛螺菌科。丰度上调菌中，拟杆菌门、不动杆菌属、颤螺旋菌属、假单胞菌目以及莫拉菌科均属于革兰阴性菌，革兰阴性细菌细胞壁的主要成分是脂多糖(LPS)，其为先天免疫反应的有效诱导剂，几乎可以刺激所有的真核细胞，导致全身的炎症反应及多器官的损伤，其主要受体是TLR-4，与之结合后可引起下游NF-κB炎症信号转导通路的激活，导致肠道屏障受损、肠壁渗漏，致使更多的致病菌及LPS循环入血，引起代谢性内毒素血症，从而导致慢性低水平炎症及胰岛素抵抗，最终发展成为T2DM[17]。厌氧芽孢杆菌属虽然属于革兰阳性菌，但是其在菌属构成中，包括艰难梭菌、产气荚膜梭菌等具有编码肠毒素和细胞毒素的细菌，相关毒素的产生也会破坏肠黏膜的完整性，导致肠道慢性炎症和胰岛素抵抗，进而参与T2DM的发生[18]。丰度下调细菌中，Blautia属的细菌可以产生乙酸和丁酸，可以通过增加肠道中短链脂肪酸的含量而减少进入血液的LPS载量，进而预防高脂饮食诱导的胰岛素抵抗等代谢性疾病的发生和发展[19]。而毛螺菌科中的很多物种也都是丁酸盐产生菌，具有修复肠道黏膜屏障的作用[20]。有研究发现，丹毒丝菌的富集与更坚固的肠道屏障黏液层的形成是正相关的，隶属于它的某些菌种也已被证实与肠道黏液的形成与性质有关，可见在糖尿病前期与糖尿病早期患者血糖代谢功能紊乱的发展过程中，丹毒丝菌发挥了一部分作用，丹毒丝菌的丰度下降，可导致肠道屏障功能减弱，引发肠道细菌易位，诱发肠道慢性炎症及胰岛素抵抗[21]。Gemella是人体口腔、呼吸道、肠道的正常菌属，其与部分组织器官的感染有关，但其与糖脂代谢的关系还有待进一步研究[22]。以上这些特异性变化菌与糖稳态失衡密切相关，通过多种发病机制参与了T2DM的发生。相关药物方面的研究也支持这一观点，如徐佳[19]发现二甲双胍通过增加有益菌Blautia属的含量来改善患者血糖和血脂代谢；黄芩-黄连药对可通过增加Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae的丰度达到降低血糖的目的[21]；参芪复方可通过调节肠道菌群，抑制慢性促炎因子的表达，减轻非特异性炎症反应，从而改善胰岛素抵抗[23]。

综上所述，糖稳态失衡患者即糖尿病前期与糖尿病早期患者的肠道菌群往往富集更多的革兰阴性菌及其他有害菌，而丁酸盐产生菌等有益菌丰度较健康人明显下降。本研究共发现12个菌群在健康人与糖稳态失衡患者间存在显著差异，这些特异性变化菌可能是参与T2DM发生过程的医学特征菌，可能可以作为新的治疗方案的参考点，为后期基于肠道菌群靶向防治T2DM提供参考。由于人体内肠道菌群的影响因素众多，包括人体自身基因、饮食结构和药物使用等[24-25]，本研究仅排除了抗生素，没有排除患者其他用药及饮食嗜好等方面对研究人群肠道菌群的影响，但选择了湿热型研究对象(一般具有相同的饮食嗜好)作为弥补；另外由于临床所限，本研究样本量较少，也没有加入非湿热证人群研究；本研究属于横断面研究，缺乏对肠道菌群的连续性变化研究，这些都是本研究存在的不足之处。未来需要进一步开展更大队列的临床研究，尽量减少影响人体肠道菌群的多种因素，更全面地了解不同血糖代谢水平人群的肠道菌群特点，特别是作为“典型”的湿热证人群糖稳态不同时期的肠道菌群特征，以期探明肠道菌群在糖耐量异常的形成和T2DM的发生过程中的作用及机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。