水果罐头中合成着色剂前处理方法的比较

丁萍 *，蔡燕斌 ，顾强，金凯

1.张家港检验认证有限公司（张家港 215600）；2.张家港海关综合技术中心（张家港 215600）；3.江苏君信新华安全科技有限公司（张家港 215600）

根据心理学家的分析结果，人们凭感觉接受的外界信息中，83%的印象来自视觉，可见产品外观的重要性。合成着色剂因其具有着色力强、色泽鲜艳、不易褪色、易溶解、易调色、价格低廉等特点，被广泛应用于食品加工业。然而，一些合成着色剂具有潜在的毒性和致癌性[1]，因此世界各国对合成着色剂的使用范围和限量都有严格的规定[2]。GB 2760—2014[3]《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》亦对合成着色剂的使用范围和限量进行了严格的规定。

目前，食品中合成着色剂的测定方法主要有薄层色谱法[4]、极谱法[5]、高效液相色谱法[6-10]、高效液相色谱-质谱法[11]等。其中高效液相色谱法得到广泛的应用，该方法中前处理方法主要有透析法[7]、固相萃取（solid phase extraction，SPE）法[12-13]、聚酰胺粉吸附法[14-16]等。其中SPE法和聚酰胺粉吸附法是当前测定合成着色剂最为普遍采用的前处理方法。然而，这两种方法操作都相对繁琐，其中聚酰胺粉吸附法经常出现难抽滤的现象，不利于批量样品处理。因此，依然有必要开发一种操作简便、准确、高效的前处理方法，以满足快速和批量检测的需求。

色素的提取试剂多使用水、乙醇-氨水[17-18]和甲醇-水[19]等，研究拟通过对比水提取法、SPE法和50%甲醇溶液提取法3种前处理方法，分析以上方法的优缺点，为高效液相色谱法测定水果罐头中合成着色剂的检测提供一种新的选择。

1 试验部分

1.1 主要材料与试剂

固相萃取柱：Sep-Pak Plus QMA 360 mg（Waters公司）；乙酸铵、氨水、盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、无水乙醇（色谱纯，Fisher公司）；水（Milipore超纯水）；柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝标准溶液（0.5 mg/mL，中国计量科学研究院）。

20 mmol/L乙酸铵溶液：称取1.54 g乙酸铵溶于1 000 mL水中；无水乙醇-氨水溶液：量取80 mL无水乙醇、1 mL氨水，加水定容至100 mL，混匀；pH 8的50%甲醇溶液：量取50 mL甲醇，加水定容至100 mL，混匀，加氨水调pH至8；盐酸-乙醇溶液（1+9）：量取80 mL乙醇、10 mL盐酸，混匀；50%甲醇溶液：量取50 mL甲醇，加水定容至100 mL，混匀。

3种水果罐头（黄桃罐头、什锦罐头、枇杷罐头），均为市售。

1.2 主要仪器与设备

Agilent 1260液相色谱仪（带DAD检测器）（美国Agilent公司）；Thermo Fisher X3R台式高速冷冻离心机（美国Thermo Fishert公司）；METTLER TOLEDO S220-K-CN pH计（梅特勒-托利多公司）。

1.3 样品处理

1.3.1 水提取法

称取2.00 g均匀水果罐头样品，置于10 mL离心管中，加入3 mL水，涡旋0.5 min，按4 000 r/min离心10 min，将上清液转移至10 mL容量瓶中，重复以上操作，将剩余残渣重复提取2次，合并上清液于10 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，经0.22 μm水相滤膜过滤后，待测。

1.3.2 50 %甲醇溶液提取法

使用50%甲醇溶液作为提取液，其他操作步骤均与水提取法相同，经0.22 μm水相滤膜过滤后，待测。

1.3.3 SPE法

参照GB/T 21916—2008《水果罐头中合成着色剂的测定 高效液相色谱法》[6]中的前处理方法，称取2.00 g均匀水果罐头样品，置于50 mL离心管中，加10 mL无水乙醇-氨水溶液，涡旋0.5 min，按4 000 r/min离心10 min，过滤，将剩余残渣重复提取3次，合并提取液并在80 ℃水浴中浓缩至约2 mL。将浓缩后的试样溶液用2%的氨水溶液调成pH 8后转移到SPE柱中，依次用3 mL pH 8的水和3 mL pH 8的50%甲醇溶液以小于2 mL/min的流速清洗，弃去流出液，再用10 mL盐酸-乙醇溶液（1+9）将着色剂洗脱出SPE柱，收集全部洗脱液至试管中，用氨水中和，在80 ℃下用氮气缓缓将洗脱液吹至近干，冷却后用50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，经0.22 μm水相滤膜过滤后，待测。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：（A）0.02 mol/L乙酸铵水溶液，（B）甲醇；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；检测波长：柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝分别为428，521，608，509，483，507和625 nm。

1.4.2 梯度洗脱程序

洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱表

1.5 标准溶液配制

分别移取400 μL柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝标准储备液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配得合成着色剂标准使用液质量浓度为20.0 mg/L。用此溶液配制质量浓度分别为0.1，0.2，0.4，1.0，3.0和5.0 mg/L的标准系列。

2 结果与讨论

2.1 线性关系和检出限

将标准系列按照上述条件进行分析，以色谱峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线，得线性回归方程及相关系数，见表2。在0.1~5.0 mg/L范围内，各合成着色剂与其色谱峰呈良好的线性关系，线性相关系数均在0.999以上。

表2 线性范围、线性方程、相关系数和检出限

将加标质量浓度逐级稀释添加于空白样品中测定信噪比，根据待测化合物信号与噪音的比值，以谱峰信噪比等于3时对应的浓度确定方法检出限，信噪比等于10时对应的浓度确定方法定量限。当称样量为2.00 g，定容体积为10 mL时，该方法检出限为0.15 mg/kg，定量限为0.5 mg/kg。

2.2 提取液甲醇溶液体积分数的选择

以甲醇溶液作为提取液，其体积分数的不同致使各着色剂的提取率也有所不同，为了得到较好的回收率，试验选用10%，30%，50%，70%和90%的甲醇溶液作提取液，进行甲醇溶液体积分数的筛选，试验结果见图1。由图1可知，当甲醇溶液体积分数为50%~90%时，各合成着色剂的回收率趋于稳定；在SPE法中，最后定容液为50%的甲醇溶液，为了能更直观地对比，故选用50%的甲醇溶液作为提取液。

图1 不同体积分数甲醇溶液的回收率对比

2.3 针式滤器的选用

在高效液相色谱测定中，为防止样液中潜在的颗粒杂质堵塞流路系统及色谱柱，常常需要使用针式滤器过滤待测样液。然而，针式滤器可能会对色素产生吸附作用，从而影响测定结果的准确性。为了评估这种影响，以不含合成着色剂的黄桃罐头为本底，添加1 mg/kg的合成着色剂，并以50%甲醇溶液提取法作为前处理方法，最终提取液分别过0.22 μm水相微孔滤膜和0.22 μm有机相微孔滤膜，上机检测，测得结果见表3。结果显示，过水相微孔滤膜的样液中7种合成着色剂的回收率为82.3%~92.7%；而过有机相微孔滤膜的样液中的7种合成着色剂中，仅有亮蓝有6%的回收率，其他均未检出。由于市售有机相微孔滤膜的材质大多为聚酰胺，这种材质对色素有很强的吸附作用，由此推断，在1 mg/kg的加标水平上，7种色素几乎全部被有机相微孔滤膜吸附住，从而严重影响测定结果的准确性。根据上述结果，在样液过滤时应选用0.22 μm水相微孔滤膜。

表3 针式滤器对回收率的影响

2.4 谱图干扰情况

GB/T 5009.35—2003[16]方法采用254 nm测定各合成着色剂，此法灵敏度不高，且样品中杂质会干扰测定。由紫外-可见扫描光谱可知，7种合成着色剂在紫外和可见波长处均有较大吸收峰，考虑到各着色剂的灵敏度以及样品基质干扰，因此采用多通道检测，各着色剂选用各自最大的吸收波长来测定，此法不仅大大提高了各合成着色剂的分离度和灵敏度，还能有效地减少杂质的干扰。以靛蓝为例，以不含合成着色剂的黄桃罐头为本底，加标量为1 mg/L，用50%甲醇溶液提取法前处理，分别在254 nm和608 nm波长下检测，如图2所示。靛蓝在608 nm波长下灵敏度高、干扰少。

图2 靛蓝加标样品在254 nm和608 nm色谱图

2.5 3种方法处理样品的回收率和精密度

以不含合成着色剂的黄桃罐头为本底，分别加入一定量的标准溶液，分别按照2.2小节的3种前处理方法处理后，用2.3小节的仪器工作条件进行测定，每个加标水平平行测定6次，结果见表4。由表4可知，水提取法的回收率在为29.0%~87.1%，SRSD为1.77%~4.79%，其中诱惑红未检出；50%甲醇溶液提取法的回收率为77.1%~92.8%，SRSD为1.46%~4.42%；SPE法回收率为73.8%~90.3%，SRSD为2.26%~8.21%。由此可见，水提取法回收率整体较低，其中诱惑红未检出，该方法不适用于水果罐头中合成着色剂的测定。50%甲醇溶液提取法和SPE法测定结果准确，相对标准偏差＜5%，两种方法均能应用于水果罐头中合成着色剂的测定；但前者操作简便、快速、成本低廉，从经济成本、工作效率的角度考虑，50%甲醇溶液提取法更优。

表4 3种方法处理样品的回收率与精密度试验结果（n=6） 单位：%

接表4

2.6 3种基质的加标回收率和精密度

选用不含有合成着色剂的黄桃罐头、枇杷罐头、什锦罐头为本底，分别加入一定量的标准溶液，用2.2.2小节中50%甲醇溶液提取法前处理，用2.3小节的仪器工作条件进行测定，每个加标水平平行测定6次，结果见表5，由表5可知，试验测得黄桃罐头、枇杷罐头和什锦罐头中回收率为77.1%~93.5%，SRSD为1.46%~4.42%，满足水果罐头中合成着色剂的检测要求。

表5 3种基质的加标回收率与精密度试验（n=6）单位：%

3 结论

试验对比了3种前处理方法在测定水果罐头中的柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝7种合成着色剂时的优缺点，对提取液甲醇溶液体积分数的选择、针式滤器的选择、谱图干扰情况、方法准确性和精密度进行了讨论。结果发现，水提取法回收率较差，不适用于水果罐头中合成着色剂的测定。50%甲醇溶液提取法和SPE法准确度和精密度均满足方法学要求，但前者操作更为简便、快速、成本更为低廉。将50%甲醇溶液提取法应用于3种不同水果罐头中加标检测，7种合成着色剂回收率为77.1%~93.5%，SRSD为1.46%~4.42%，此法准确可靠，重现性好，能够适用于水果罐头中7种合成着色剂的快速筛查和批量样品检测，为高效液相色谱法测定水果罐头中合成着色剂的检测提供一种新的选择。