益黄散治疗小儿慢性腹泻的网络药理学研究

刘思佳，谢静

益黄散治疗小儿慢性腹泻的网络药理学研究

刘思佳，谢静*

湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

采用网络药理学探讨益黄散治疗小儿慢性腹泻的分子作用机制，为临床用药提供依据。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）挖掘益黄散药物有效成分，导入PubChem、SwissTargetPrediction数据库预测有效成分潜在靶点；在GeneCards数据库中检索小儿慢性腹泻靶点，将有效成分靶点与疾病靶点取交集，并绘制中药-有效成分-疾病网络。通过STRING 11.0数据库构建蛋白相互作用网络，运用Cytoscape3.8.1软件Network analyzer功能整合并构建药物成分-靶点-疾病的多层次网络关系。通过DAVID数据库对交集靶点进行GO功能富集及KEGG通路富集分析。收集并筛选益黄散有效成分19个、药物靶点541个，小儿慢性腹泻疾病靶点2574个，二者交集靶点134个，其中PIK3CA、STAT3、VEGFR、AKT1、EGFR等基因靶点相互作用明显。GO功能富集得到生物过程条目358个，细胞成分条目4个，分子功能条目42个；KEGG通路富集共计82条信号通路，主要调控癌症途径、癌症中蛋白聚糖、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路、局灶性粘连、MAPK信号通路等。本研究揭示了益黄散在小儿慢性腹泻治疗中多途径、多靶点、多成分的作用特点，可为后续研究提供理论基础。

益黄散；腹泻；小儿慢性腹泻；网络药理学；信号通路；靶点

小儿慢性腹泻（infantile chronic diarrhea）是婴幼儿常见病、多发病，病程＞2个月者为慢性腹泻，若病情迁延不愈可影响小儿生长发育，是造成儿童生长发育障碍的主要原因。目前临床治疗小儿慢性腹泻多用肠道黏膜保护剂或肠道微生态制剂改善肠道微生态环境，从而实现止泻[1]。

益黄散出自宋代钱乙《小儿药证直诀•卷上•脉诊治法》，又名补脾散，方中青皮、陈皮、丁香理气祛湿，诃子收敛固涩，甘草调中补益，全方行气祛湿，则脾气自运[2]。益黄散现代常用于治疗婴幼儿腹泻、小儿消化不良，改善机体免疫力等[3]。明代万全评价益黄散“治脾胃寒湿太甚，神品之药也。以补脾胃之虚误矣”。万全在钱乙对小儿体质辨为“易虚易实，易寒易热”的基础上提出“脾常不足”，指出“脾胃虚弱，万病峰起”，脾胃功能直接关系小儿机体健康及生长发育[4]。本研究通过网络药理学研究益黄散中各药物成分，探讨益黄散治疗小儿腹泻的作用机制。

1 材料与方法

1.1 益黄散有效成分及靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[5]收集益黄散中陈皮、丁香、诃子、青皮4味药的有效成分，因甘草为常用佐使药，本文不予讨论。根据人体药物的吸收、分布、代谢、排泄、毒性参数，以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18为条件进行主要有效成分筛选[6]。

1.2 中药有效成分靶点预测与疾病靶点预测

通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）[7]获取中药有效成分结构，并保存为SDF格式，将其导入SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）[8]中进行靶点预测，剔除无法预测的有效成分。

通过GeneCards数据库[9]（https://www. genecards.org/），以“infantile chronic diarrhea”为检索词进行检索，获取疾病靶点。

1.3 药物-疾病共同靶点获取

在生物信息学在线网站（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/Venn/）导入中药有效成分预测靶点与疾病靶点的相关基因数据，绘制韦恩图，交集靶点为药物成分-疾病共同靶点。

1.4 蛋白相互作用网络构建

将共同靶点导入STRING 11.0数据库（http://www.string-db.org）[10]，选用Multiple proteins工具，物种组织设定为“homo sapiens”，设置默认参数值，筛选出网络关键靶点，获得交集靶点的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，得到PPI网络图。将PPI网络CSV格式文件导入Cytoscape3.8.1软件[11]，绘制中药-有效成分-疾病网络。对网络拓扑结构信息进行计算，在工具Analyze Network中调整degree值，以节点degree值反映靶点作用大小，根据degree值对靶点进行筛选分析。利用BisoGenet插件3.3.0对药物-疾病-靶点进行PPI构图分析。

1.5 生物通路分析

将筛选后得到的共同靶点通过WebGesstalt数据库（https://www.webgestalt.org/#）[12]进行基因本体论（GO）分析，限定物种为“homo sapiens”进行ORA（over-representation analysis）分析，设定显著性水平＜0.05，获得药物靶点的生物过程，分别导出细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）条目进行分析，进行加权集合覆盖分析后绘制火山图。

利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）[13]进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，收集＜0.01、最小计数为3、富集因子＞1.5的条目，对排名前20位的通路与靶点整合构建通路图。

2 结果

2.1 益黄散有效成分及对应靶点

通过TCMSP共检索出益黄散有效成分314个，其中陈皮63个、青皮18个、丁香117个、诃子116个，剔除无化学结构及靶点的有效成分，经筛选后得到符合标准的有效成分19个，其中包括陈皮5个（MOL000359、MOL004328、MOL005100、MOL005815、MOL005828），丁香4个（MOL000358、MOL000422、MOL000449、MOL000098），青皮4个（MOL001803、MOL004328、MOL005100、MOL005828），诃子6个（MOL009135、MOL001002、MOL009149、MOL009137、MOL006826、MOL009136）。通过PubChem数据库获取益黄散有效成分对应靶点541个。

2.2 疾病靶点及交集靶点

通过GeneCards数据库筛选获得小儿慢性腹泻靶点2574个，设置Relevance score＞4.902935028（两倍中位数），经筛选后得到645个靶点，取中药有效成分靶点与疾病靶点交集，得到交集靶点71个（见图1）。

图1 益黄散-小儿慢性腹泻基因靶点韦恩图

2.3 蛋白相互作用网络

将交集靶点导入STRING 11.0数据库，设置minimum required interaction score为最高置信度0.9，隐去游离节点后，得到71个节点、155条连线关系，构建PPI网络图（见图2）。71个节点的平均degree值为4.37，节点越大，degree值越高，连线越多，表示蛋白之间的关系越紧密[14]。PPI网络显示，共有靶蛋白的节点58个，表示相互作用的线155条，其中血管内皮生长因子（VEGFA）与转录激活因子3（STAT3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、编码p53蛋白（TP53）等相互作用。

2.4 GO功能富集分析结果

BP富集结果共计358个，主要富集于跨膜转运的正调控、对药物的反应、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、蛋白质自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡过程的负调控、积极调控细胞增殖、凋亡过程的负调控、细胞运动的正调控，氧代谢过程、神经递质的调节、类固醇代谢过程、DNA转录因子的调控、从RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、从RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控、蛋白质磷酸化、积极调节GTPase活性、信号转导。见图3。

图2 益黄散治疗小儿慢性腹泻靶点PPI核心网络

图3 益黄散治疗小儿慢性腹泻GO功能富集生物过程分析

CC富集结果共4个，主要富集于内体、复合物的组成部分，见图4。

图4 益黄散治疗小儿慢性腹泻GO功能富集细胞组分分析

MF富集结果共42个，富集于蛋白质结合、ATP结合、磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶活性、相同的蛋白质结合、锌离子结合、蛋白质均二聚活性、丝氨酸型内肽酶活性、激酶活性，见图5。

图5 益黄散治疗小儿慢性腹泻GO功能富集分子功能分析

2.5 KEGG通路富集分析结果

KEGG通路富集共计82条信号通路，主要富集于癌症途径、癌症中蛋白聚糖、肾素-血管紧张素（Ras）信号通路、PI3K-Akt信号通路、局灶性粘连、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、人疱疹病毒（EB）感染、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、甲型流感等。根据“Term”选取log10值排名前20位的结果将其进行可视化。见图6。

图6 益黄散治疗小儿慢性腹泻KEGG富集分析

3 讨论

3.1 益黄散治疗小儿慢性腹泻的应用

小儿慢性腹泻发病机制复杂，目前认为其病因分为感染性因素和非感染性因素，感染性因素包括病毒、细菌、真菌等病原菌感染，非感染性因素则包括气候因素或长期饮食喂养不当及免疫功能低下等。由于小儿胃肠功能尚未发育完全，小肠黏膜被病毒或其他病原微生物直接侵袭，导致肠道微生态平衡及肠黏膜完整性被破坏，引起肠道内电解质和水运转出现失调，导致腹泻[15]。据相关文献报道，益黄散具有促进免疫蛋白IgA、IgG表达，提高炎症控制效果，改善机体免疫功能的功效[16]。

腹泻属于中医学“泄泻”范畴，中医认为腹泻的发生与脾虚密切相关，脾气健运则外邪不侵。钱乙注重脾胃气机升降，善用甘温运化之药。益黄散方中陈皮、青皮专理肝脾宿痰、燥湿理气，丁香温中止呕，诃子涩肠止泻，甘草补脾和胃。小儿脾常不足，脾胃未臻完善，饮食不知节制，乳食积滞于内，选用益黄散取其运脾为贵之意。江育仁教授提出“故欲健脾者旨在运脾，欲使脾健，则不在补而贵在运也”的学术思想[17]。现代小儿脾胃病中虚弱不足者明显减少，但饮食不节导致脾胃功能失健者大增，运脾法受到各医家重视与运用。

3.2 关键靶点结果分析

对益黄散治疗小儿慢性腹泻PPI网络拓扑分析可知，PIK3CA、表皮生长因子受体（EGFR）、VEGFA、STAT3、AKT1、TP53的degree值较大，说明益黄散的生物活性成分与这些蛋白质的结合率较高。对交集靶点进行GO功能富集分析发现，核心靶点主要富集于跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、对药物的反应、蛋白质自磷酸化等生物过程。PIK3CA主要参与免疫相关、炎症相关、凋亡抑制、能量代谢等信号通路。EGFR靶点表达在人肠上皮细胞的基底外侧表面膜上[18]。小儿慢性腹泻易伴随肠道炎症，肠道菌群失调，严重时可引起局部缺血，发生微循环障碍。酪氨酸激酶受体（ErbB）抑制剂可抑制肠上皮细胞EGFR信号传导，降低肠上皮的生长和修复能力，导致肠黏膜萎缩和分泌性腹泻。激活EGFR有助于修复肠道黏膜上皮细胞，吸收肠液，缓解腹泻。VEGFA是一种能诱导血管内皮细胞增殖与迁移的因子，与炎性指标、疾病活动及功能指标具有正相关性，参与固有免疫调节，VEGFA能促进血管生成，改善肠道缺血缺氧环境[19]。信号传导及STAT3与自身免疫疾病、复发性感染等疾病有关，对辅助性T细胞17的分化有重要作用。STAT3是一类位于染色体17q21区域的转录因子，EGFR刺激DNA结合蛋白酶的STAT3产生反应，其激活引发的炎症反应可能导致肠上皮屏障功能失调，以及与电解质和水运输失调相关的肠道炎症，从而导致腹泻[20]。研究表明，microRNA可通过靶向抑制STAT通路分子STAT3蛋白表达，进而抑制肠道病毒71的核酸和蛋白复制[21]。AKT1广泛表达于人体各个组织，参与细胞生存及生长调控，在细胞的生长与凋亡中起到重要作用。AKT1可能是通过提高细胞因子活性、促进病变细胞凋亡以达到治疗小儿慢性腹泻的目的[22]。

3.3 通路与生物过程分析

KEGG通路富集分析结果表明，益黄散涉及的主要炎症通路有PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路。PI3K-Akt信号通路对细胞代谢具有多样化的下游效应，可直接调控营养转运蛋白和代谢酶，调节关键的代谢过程，在肠道炎症中发挥重要作用[23]。腹泻的发生与炎症反应、肠道内微环境变化密切相关[22]。PI3K信号通路一旦被激活，引起Akt磷酸化，进而通过p53非依赖方式抑制细胞凋亡。鉴于炎症因子与凋亡存在一定相关性，推测益黄散治疗小儿慢性腹泻可能通过促进PI3K-Akt信号通路表达，抑制肠道上皮细胞凋亡，控制肠炎发生[22]。腹泻在缺血缺氧的肠道疾病中十分常见，有研究表明，HIF-1是一种普遍存在的缺氧反应因子，是黏膜损伤期间肠道屏障保护的关键因素，参与多种有助于维持屏障完整性的机制，可以控制肠黏膜上皮离子和水运输[24]。小儿慢性腹泻可能引起机体微环境甚至肠道菌群的变化，肠道菌群与腹泻的发生互为因果，机体局部缺血缺氧可激活HIF-1通路，增加基因表达。MAPK信号通路是引起机体胃肠动力功能紊乱及参与促炎因子应答的关键通路，参与炎症调控、应激反应等过程[25]，与细胞反应的组织损伤有关。因此益黄散可能通过某些重要蛋白靶点调控PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路等，在抑制肠道炎症反应、减轻肠道损伤、保护肠道黏膜、改善机体微环境等方面发挥重要作用。

中药对疾病的干预作用具有“多因微效”综合调节的特点[26]，中药化学成分复杂且复方组合形式多样，各中药成分之间彼此协调作用。本文基于网络药理学研究，探讨益黄散治疗小儿慢性腹泻机制，为中医药多途径、多靶点、多成分治疗疾病提供理论依据。但本文结果尚缺乏相关动物实验及临床验证，有待进一步研究。

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Study onPowder for the Treatment of Infantile Chronic Diarrhea Based on Network Pharmacology

LIU Si-jia, XIE Jing*

(Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

To study the molecular mechanism ofPowder for the treatment of infantile chronic diarrhea with network pharmacology; To provide basis for clinical medication.The active components ofPowder were dug from TCMSP, and then PubChem and SwissTargetPrediction databases were imported to predict potential targets of active components; the targets of infantile chronic diarrhea were searched in GeneCards database, the intersection of active component targets and disease targets was taken, and the Chinese materia medica-active components-disease network was drawn. The protein - protein interaction network was constructed by STRING 11.0 database and Cytoscape3.8.1 Network analyzer was used to integrate and construct the multi-level network relationship of medicine composition-target-disease. GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of intersection targets were carried out through DAVID database.Totally 19 active components, 541 medicine targets ofPowder, 2 574 disease targets of infantile chronic diarrhoea, and 134 intersection targets of the two were collected and screened, among which the gene targets of the PIK3CA, STAT3, VEGFR, AKT1, and EGFR were obvious. GO function enrichment resulted in 358 biological process entries, 4 cell component entries and 42 molecular function entries;KEGG pathway was enriched with 82 signaling pathways, mainly regulating cancer pathway, proteoglycan in cancer, Ras signaling pathway, PI3K - Akt signaling pathway, focal adhesion, MAPK signaling pathway, etc.This study reveals the multi-channel, multi-target and multi-component characteristics ofPowder in the treatment of infantile chronic diarrhea, so as to provide a theoretical basis for follow-up research.

Powder;diarrhea; infantile chronic diarrhea; network pharmacology; signaling pathway; target

刘思佳,谢静.益黄散治疗小儿慢性腹泻的网络药理学研究[J].中国中医药图书情报杂志,2022,46(2):9-14.

R272；R285

A

2095-5707(2022)02-0009-06

10.3969/j.issn.2095-5707.2022.02.002

湖南中医药大学中医学国内一流建设学科（4901-0200002002）

刘思佳，E-mail: 1250479541@qq.com

谢静，E-mail: 982100692@qq.com

（2021-08-05）

（修回日期：2021-09-06；编辑：魏民）