LncRNA MEG3及miR-15a-5p在慢性阻塞性肺疾病中的表达及临床意义

魏小婉 鲁美霞 高佳男 李晓博 楚荷莹

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是呼吸系统发病率最高、影响力最大的一种疾病，简称为慢阻肺[1-3]。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一种长度超过200nts的非编码转录本，虽不能表达遗传信息但在细胞生物学行为及疾病的发生过程中都有十分关键的影响[4-5]。研究显示慢阻肺患者的lncRNA表达水平与健康者有十分大的差别[6-9],其中就包括lncRNA MEG3。微小RNA(microRNA )是一种内源性非编码RNA，它可以裂解mRNA使其失活并抑制翻译过程[10], 研究表明lncRNA可通过与miRNA相互作用参与多种病理过程[11]。有研究显示慢阻肺患者miR-15b-5p的表达高于不吸烟的健康者[12-13]，本研究通过ENCORI(The Encyclopedia of RNA interactomes)数据库预测出miR-15a-5p可与lncRNA MEG3相互作用。miR-15a-5p与miR-15b-5p同为miR-15家族[14]具有相似的生理作用。因此笔者预测lncRNA MEG3也可能通过miR-15a-5p介导慢阻肺的发生发展。

资料与方法

一、研究对象

选取2020年8月至2021年4月在郑州大学第一院就诊的慢阻肺患者共43例，其中急性加重期28例，稳定期15例及健康者26例。

1 慢阻肺组入组标准：(1) 根据2020年GOLD[3]中慢阻肺的诊断标准确诊为慢阻肺者。(2)急性加重期患者来源于郑州大学第一附属医院呼吸内科病房的住院病人，具有明显的胸闷、喘息等临床症状，且有因慢阻肺急性加重住院治疗的需求。(3)稳定期患者处于疾病稳定期，没有呼吸道症状短期内迅速变差，并且3个月内无口服皮质醇类或抗生素史。

2 慢阻肺组排除标准：(1)患有呼吸系统的其他疾病(如哮喘、处于活动期的肺结核、肺脓肿、肺间质纤维化、肺癌等)。(2)患有严重的肝功能衰竭，肾功能损害，心、脑血管疾病及恶性肿瘤等。(3)年龄超过85岁或小于18岁。

3 对照组：选取同期于我院检查并符合排除标准的健康者26例为对照组，入选者均无呼吸系统疾病。

本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，伦理审查编号：2021-KY-0472-003，所有患者均获得知情同意。

二 、材料与试剂

见表1。

表1 材料与试剂

三、实验方法

1 血液标本采集处理：使用EDTA抗凝采血管采集所纳入的慢阻肺患者入院24小时内及同期健康对照组外周静脉血标本3～5mL，以4℃、1500rpm的速率离心10min，弃上清。血细胞用红细胞裂解液(北京 索莱宝)裂红2次后加入2mL无血清冻存液(苏州 新塞美)，移至冻存管中编码封装，于-80℃冰箱中冷冻保存。

2 使用qRT-PCR法检测LncRNA MEG3的表达水平：将细胞从-80℃冰箱中取出后迅速放置于37℃恒温水浴锅中使细胞复苏，按照试剂说明书提取总RNA(使用总RNA快速提取试剂盒 北京 博迈德)，再根据cDNA合成试剂盒(北京 康为)逆转录合成cDNA。最后按照qRT-PCR试剂盒(美国 Everbright)的使用说明，加入PCR所需试剂，在qRT-PCR仪器(美国 Thermo Fisher)上进行操作，所有样本均重复三次。以GAPDH表达水平作为内参照，各组患者LncRNA MEG3的表达量均采用2-ΔΔCt法计算。引物列表如下：lncRNA MEG3-F primer：GCCCTGACCTTTGCTATGCT； lncRNA MEG3-R primer：TCGACAAAGACTGACACCCC；GAPDH F primer：TGACCACAGTCCATGCCATCAC；GAPDH R primer：GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA。

3 使用qRT-PCR法检测miR-15a-5p的表达水平：细胞复苏及总RNA提取同上，采用加Poly(A)尾法使用miRNA cDNA合成试剂盒(北京 康为)逆转录合成cDNA。同样根据miRNA qRT-PCR试剂盒(北京 康为)使用流程，在 PCR仪上进行反应，所有样本均重复三次，以U6表达水平作为内参照，各组患者miR-15a-5p的表达量均采用2-ΔΔCt法计算。引物列表如下：hsa-miR-15a-5p F primer: CCCTAGCAGCACATAATGGTTTG；hsa-miR-15a-5p R primer: 试剂盒通用引物；U6 F primer: CTCGCTTCGGCAGCACA；U6 R primer: AACGCTTCACGAATTTGCGT。

4 采集各入组患者临床资料：包括入院24小时内检验结果、慢性阻塞性肺疾病评估测试问卷(CAT)评分，48小时内我院肺功能检查结果。

四、统计学处理

结 果

一、三组患者基本资料、实验室检查及肺功能指标等比较

急性加重组与稳定期组及健康对照组相比，男性多于女性，年龄较大，且BMI相对偏低。急性加重组GOLD分级多为重度、极重度，稳定期组多为轻、中度，两者具有显著不同。急性加重组CAT评分显著高于稳定期组。肺功能检查指标均低于处于稳定期组患者，去年急性住院中位次数多于后者(见表2)。

二、各组患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p指标慢阻肺组LncRNA MEG3相对表达量为1.43±1.29，高于对照组1.0±0.00(P=0.043)；miR15a-5p相对表达量为0.63±0.48，低于对照组1.0±0.00(P=0.001)。

表2 三组患者基本资料、实验室检查及肺功能指标等

将慢阻肺组分为急性加重组与稳定期组，比较三组患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p的相对表达。急性加重组LncRNA MEG3相对表达量为1.67±1.55，稳定期组为0.99±0.29，急性加重组高于稳定期组(P=0.04),也明显高于对照组(P=0.16)。急性加重期miR-15a-5p相对表达量为0.60±0.39，稳定期为0.67±0.60，急性加重组明显低于对照组(P<0.001)。(见图1，2)。

图1 三组患者LncRNA MEG3表达量注：*P<0.05

图2 三组患者miR-15a-5p表达量注：*P<0.05,****P<0.001,nsP>0.05

三、慢阻肺患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p及其与临床指标相关性分析

慢阻肺患者中LncRNA MEG3表达水平与miR-15a-5p成负相关(r=-0.396，P=0.02)，与CAT评分及C反应蛋白成正相关(r分别为0.478，0.508，P分别为0.002，0.003)，与是否吸烟、住院时长、GOLD分级、肺功能指标等均无相关性(图3-5)。

图3 LncRNA MEG3与miR-15a-5p相关性

图4 LncRNA MEG3与CAT评分相关性

图5 LncRNA MEG3与CRP相关性

四、ROC曲线及Logistic回归分析LncRNA MEG3及miR-15a-5p对慢阻肺患者的诊断能力

应用ROC曲线分析LncRNA MEG3诊断出慢阻肺的最佳临界值为0.804，曲线下面积为0.661(95%CI0.5239～0.7981)，灵敏度及特异度分别为76.92%及60%。应用ROC曲线分析miR-15a-5p诊断出慢阻肺的最佳临界值为0.56，曲线下面积为0.66(95%CI0.490～0.834)，灵敏度及特异度分别为50%及77.27%。应用LncRNA MEG3联合miR-15a-5p诊断出慢阻肺的曲线下面积为0.721(95%CI0.5755～0.8669)，灵敏度及特异度分别为81.82%及55%(详见图6～8)。单因素二元Logistic回归分析确定了几个影响慢阻肺发生的重要因素(因变量：慢阻肺组赋值为1，对照组赋值为0；自变量：男性赋值为1，女性赋值为0；吸烟赋值为1，不吸烟赋值为0，分类协变量以取值水平最小的作为参照)。进一步多因素Logistic回归分析其中吸烟为慢阻肺发生的危险因素(OR20.239，95%CI0.904～11.066，P=0.001)，miR-15a-5p为保护性因素(OR0.029，95%CI1.140～9.718，P=0.002)(见表3)。

表3 Logistic回归分析影响慢阻肺发生的因素

图6 LncRNA MEG3诊断COPD的ROC曲线

图7 miR-15a-5p诊断COPD的ROC曲线

图8 LncRNA MEG3联合miR-15a-5p诊断COPD的ROC曲线

讨 论

慢性阻塞性肺疾病(COPD)大多是由于暴露于有害气体引起的，其病理改变为气道内持续慢性高炎症水平造成肺泡结构破裂融合、血管内皮受损、血管管壁增厚管腔狭窄，主要临床特征为长期连续的气流受限(不能完全恢复)[3]，许多因素参与了慢阻肺的发展过程，但是具体详细的分子通路还不完全清晰。由于高通量测序技术日渐成熟，生物信息技术被越来越多的应用于医学领域，人们不断发现出与慢阻肺相关的LncRNA[15]，研究表明lncRNA1(SALRNA1)可通过同时调控SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a两条信号通路，介导肺泡Ⅱ型肺泡上皮细胞的衰老[16]；Tang等通过收集慢阻肺患者和非慢阻肺患者的肺组织，经基因芯片技术挖掘与慢阻肺发病相关的lncRNA，发现lncRNA MEG3与LncRNA TUG1显著上调表达[17]。LncRNA TUG1可通过上调α-SMA和纤维蛋白的表达，抑制人肺上皮细胞和肺成纤维细胞的增殖[17]，并抑制慢阻肺中miR-145-5p/DUSP6轴来促进气道重塑[18]。研究表明lncRNA MEG3可通过miR-218介导CRP、IL-1β、IL-6和单核细胞趋化蛋白-1等炎症因子的表达来调节香烟烟雾诱导的肺内皮细胞凋亡和炎症反应[9]。本研究发现慢阻肺患者外周血中lncRNA MEG3表达水平高于健康者，与稳定期组相比急性加重组lncRNA MEG3表达升高尤为突出，并且与炎症因子CRP成强正相关，与CAT评分成正相关。这与既往研究结果相符，表明lncRNA MEG3可能通过促进CRP等炎症介质的产生参与了慢阻肺的发生发展，并且lncRNA MEG3水平越高则患者症状及疾病严重程度越重。

据报道miRNA可以负向调节mRNA并抑制翻译过程，从而可以根据不同的细胞类型，不同程度的抑制蛋白质输出至能起作用的最佳水平[19-20]。其中miR-15a-5p不仅在包括肾癌、肝细胞癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤发生中起重要作用[21-22]，通过调节人体内巨噬细胞的炎症反应参与败血症的发生[23]，还可以通过调控VEGF/p38/MMP-2信号通路诱导肺动脉高压的发生[24]。但其在慢阻肺中的作用尚不清楚。越来越多证据表明lncRNA MEG3通过与miRNA相互结合发挥作用，本研究通过ENCORI数据库预测出miR-15a-5p是lncRNA MEG3的潜在靶标，因此笔者预测lncRNA MEG3可能通过miR-15a-5p参与慢阻肺的发展。本研究发现miR-15a-5p在慢阻肺患者中明显的降低，且急性加重组中miR-15a-5p降低更为显著。并且慢阻肺患者中miR-15a-5p的表达水平与lncRNA MEG3呈显著负相关。这与Ezzie[12]的研究中miR-15b-5p在肺泡灌洗液中表达水平升高不同，其原因可能由于检测的样本不同，有学者报道同一患者的血浆和支气管肺泡细胞学之间的miRNA 没有明显的关系[25]，并且尚未有人研究过慢阻肺患者肺组织或外周血中miR-15a-5p的表达水平，故无从得知miR-15a-5p在慢阻肺患者中的表达是否与miR-15b-5p一致。但Yuan等发现miR-15a-5p抑制剂可恢复细胞侵袭、凋亡的作用[26]，本研究经过多因素Logistic回归分析发现miR-15a-5p是慢阻肺发生的唯一保护性因素(OR0.029，P=0.002)与此研究相符，故笔者推测慢阻肺患者miR-15a-5p的低表达可能缓解炎症因子及细胞凋亡。通过ROC曲线分析发现lncRNA MEG3及miR-15a-5p都对慢阻肺具有一定的诊断价值AUC分别为0.661、0.66。灵敏度及特异度分别为76.92%、50%及60%、77.27%。lncRNA MEG3的灵敏度高但特异性较低，而miR-15a-5p的特异性高但灵敏度较低，两者相结合对慢阻肺有较好的诊断介质，AUC为0.721灵敏度及特异度分别为81.82%及55%。

我们的研究中未发现慢阻肺患者lncRNA MEG3及miR-15a-5p的表达水平并与是否吸烟以及肺功能指标等有明显相关性，可能是因为慢阻肺中lncRNA-micro RNA基因调控网络复杂，对人体内生物学行为的调控受多种因素的影响。并且我们收集的标本数目有限，并且临床指标的个体差异性较大，受影响因素较多，因此其与各临床指标的关系需进一步研究。

本研究存在一定的局限性，未来我们将通过细胞模型，基因敲除或过表达及双荧光素酶实验明确慢阻肺患者lncRNA MEG3与miR-15a-5p的具体传导通路。总之，慢阻肺患者外周血中lncRNA MEG3表达水平升高，miR-15a-5p表达水平明显下降并且与疾病严重程度相关，lncRNA MEG3联合miR-15a-5p对慢阻肺有较好的诊断价值，我们推测LncRNA MEG3通过负向调节miR-15a-5p介导慢性阻塞性肺疾病的进展。