粗糠柴霉素通过调控PAK6基因的表达对非小细胞肺癌细胞A549增殖、凋亡以及放射敏感性的影响

穆双锋 李敬霞 庞然然

肺癌是五大癌症之一，世界上最常见的癌症，也是死亡率最高的癌症。主要分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer cell，NSCLC)和小细胞肺癌，两者在肺癌中占比分别为85%和15%。肺癌的治疗手段主要是手术、放射、化疗和分子靶向药物治疗的方式，通常患者常接受两种或两种以上的治疗方式[1]。粗糠柴霉素，即Rottlerin，是一种提取自印度和中国传统中药材粗糠柴的化合物，具有驱绦虫、治疗疥疮和疱疹的癣的作用。粗糠柴霉素是蛋白激酶 C(protein kinases C, PKC)的选择性抑制剂[2]。近年的研究发现，粗糠柴霉素针对很多肿瘤都有抑制作用，其在乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、肺癌的治疗研究中都发现有显著的抑癌效果[3-7]。p21活化激酶(p21-activated kinase 6，PAK6)在肺癌、结肠癌等癌组织中都有过量表达，促进肿瘤发展[8-10]。干扰PAK6表达可以诱导乳腺癌细胞的凋亡，增强乳腺癌细胞的放射敏感性[11]。本研究以NSCLC A549细胞为研究对象，以不同浓度粗糠柴霉素处理和过量表达PAK6的方法来检测粗糠柴霉素抑制A549细胞增殖、促进凋亡的作用机制和对放射敏感性的影响，探寻粗糠柴霉素对抑制非小细胞肺癌的临床意义。

资料与方法

一、材料

人非小细胞肺癌细胞系A549购自ATCC；DMEM培养基(dulbecco's modified eagle medium)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco公司，胰蛋白酶Trypsin、四氮唑蓝(MTT)和二甲基亚矾(Dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma-Aldrich公司；双抗、抗PAK6抗体和抗GAPDH抗体购自Abcam公司；Total RNA提取试剂盒、 real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自美国Invitrogen公司；双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

二、方法

1 细胞培养：A549细胞在10 % FBS+DMEM培养基+1% 青霉素+1% 链霉素的细胞培养液中，37℃ 5% CO2环境中常规培养。待细胞生长融合成单层时，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)清洗三次，再用Trypsin消化传代。

2 MTT实验测定细胞增殖抑制率：将终浓度为0、2、4、8、16 μM的粗糠柴霉素加入A549细胞，连续培养24 h、48 h、72 h，加入 20 μL(5 g/L)MTT，反应4 h后加入150 μL DMSO，室温振荡5 min溶解甲瓒结晶，在Bio-Rad全自动酶标仪测定OD492 nm 处的吸光度(A)值，计算抑制率(%)=(对照组A均值-实验组A均值)/实验组A均值×100%。并确定半数抑制浓度的粗糠柴霉素最佳处理时间。

3 细胞转染：将A549细胞稀释为密度1×106个/mL，接种于6孔板中(200 μL/孔)，待细胞生长融合成一层时按照Lipofectamine 2000说明书的步骤，将Lipofectamine 2000、pcDNA和pcDNA-PAK6在无血清OptiMEM培养液中稀释，之后取等体积Lipofectamine 2000和pcDNA或pcDNA-PAK6轻轻混匀，静置20 min，将混合液加至6孔板中，轻轻晃动6孔板，混合均匀后置培养箱中继续培养6h，之后换成完全培养基，转染48h后收集A549细胞进行后续实验。细胞分为对照组、粗糠柴霉素组(8μM粗糠柴霉素处理48 h)、粗糠柴霉素+pcDNA组(转染pcDNA后经8μM粗糠柴霉素处理48 h)、粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6组(转染pcDNA-PAK6后经8μM粗糠柴霉素处理48 h)。

4 Real-timePCR检测mRNA的表达：按照Total RNA提取试剂盒的说明书，进行各组A549细胞总RNA的提取，测定浓度和纯度后保存于-80℃超低温冰箱。通过反转录PCR试剂盒制备cDNA，real-time PCR试剂盒在Bio-Rad Real-time PCR仪，按照95℃ 7 min；95℃ 40s、58℃ 42s、72℃ 35s(35个循环)；72℃ 10 min的程序进行反应，Bio-Rad公司的IQ5TM Real-time PCR Detection System分析数据。PAK6 上游引物 5′-GACTCCATCCTGCTGACCCTC-3′，下游引物 5 ′-CACCTCAGTGGCATACAAAGACC-3′；GAPDH(内参照)上游引物 5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′，下游引物 5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′。

5 流式细胞术测定细胞凋亡率：收集各组A549细胞，遵循Annexin V/PI 试剂盒说明书的指示，以5 μL膜联蛋白V-FITC标记的 (Annexin V-FITC) 和5 μL 碘化丙啶(PI)避光染色，15 min后在流式细胞仪分析细胞凋亡率。

6 克隆形成实验测定放射处理后细胞存活分数：取各组A549细胞细胞浓度稀释至1×104个细胞/孔，接种于6孔培养板培养过夜。然后将细胞分别暴露于不同剂量下(0、2、4、6、8Gy)进行照射处理，照射条件：室温照射，靶距100 cm，照射面积12.5 cm×8.5 cm，美国VarianX直线加速器。取500个细胞/皿接种于细胞培养皿中，设3个重复，加入10mL培养液混合均匀，于37℃ 5% CO2培养箱中培养，培养至出现肉眼能清晰可见的细胞克隆(约2周)，弃去培养液，洗涤2次，4%冷的甲醛固定细胞15 min，弃固定液，洗涤2次，吉姆萨染色30 min，自来水清洗，室温晾干后计数，所形成的细胞集落>50个时为有效菌落。根据单机多靶模型拟合细胞存活曲线，计算放射增敏比(SER)。计算细胞克隆形成率 = (细胞克隆数平均值/铺板细胞总数)×100%，细胞存活分数(survival fraction,SF) = 受照射细胞克隆形成率/对照细胞克隆形成率)×100%。

7 Western blot检测蛋白表达：将对照组、粗糠柴霉素组、粗糠柴霉素+pcDNA组、粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6组A549细胞加入RIPA，超声破碎抽提蛋白。蛋白以4 ∶1的比例加入5×上样缓冲液，混匀后煮沸10 min，进行SDS-PAGE，转到硝酸纤维素膜，封闭后于4℃与500倍稀释的一抗PAK6孵育过夜，于室温与1 000倍稀释的二抗孵育1h，显影后凝胶成像系统扫描，以GAPDH 为内参照，分析PAK6表达水平。

三、统计学处理

结 果

一、粗糠柴霉素抑制A549增殖

粗糠柴霉素处理A549 24 h、48 h、72 h，MTT实验结果显示：与粗糠柴霉素0μM组相比，2、4、8、16 μM粗糠柴霉素在24 h、48 h、72 h细胞抑制率均显著升高(P<0.05)；与粗糠柴霉素2μM组相比，4、8、16 μM粗糠柴霉素在24 h、48 h、72 h细胞抑制率均显著升高(P<0.05)；与粗糠柴霉素4μM组相比，8、16μM粗糠柴霉素在24h、48h、72h细胞抑制率均显著升高(P<0.05)；与粗糠柴霉素8μM组相比，16μM粗糠柴霉素在24h、48h、72h细胞抑制率均显著升高(P<0.05)；粗糠柴霉素抑制肺癌细胞生长的作用随着给药剂量的增加和处理时间的延长而逐渐增强(P<0.05)(见表1)。根据实验结果，选取处理时间48h，抑制率为50%左右的粗糠柴霉素浓度(8μM)用作后续实验。

表1 不同浓度粗糠柴霉素对肺癌细胞A549抑制率的影响

二、粗糠柴霉素促进A549凋亡

流式细胞术实验结果显示，与对照组凋亡率相比，8μM粗糠柴霉素处理A549细胞48h后肺癌细胞A549的凋亡率显著增加(P<0.05)(见图1和表2)。

图1 流式细胞术检测粗糠柴霉素处理后A549细胞凋亡率

表2 粗糠柴霉素对肺癌细胞A549凋亡的影响

三、粗糠柴霉素增加A549的放射敏感性

克隆形成实验结果表明，与对照组相比，随着照射剂量的增加，粗糠柴霉素组A549的细胞存活分数逐渐下降，且差异显著(P<0.05)(见图2)，放射增敏比为1.663，表明粗糠柴霉素可增加A549的放射敏感性(见表3)。

图2 不同剂量照射后A549细胞的存活曲线注：与对照组比较，*P<0.05

四、粗糠柴霉素抑制A549中PAK6蛋白的表达

qRT-PCR和Western blot的结果表明，与对照组相比，粗糠柴霉素处理组A549细胞中PAK6的mRNA和蛋白的表达量均显著降低(P<0.05)(见图3、表3)。

图3 A549中的PAK6蛋白表达水平

表3 粗糠柴霉素对肺癌细胞A549中PAK6表达的影响

五、PAK6蛋白过表达逆转了粗糠柴霉素抑制A549增殖和促进凋亡的作用

Western blot结果表明，与粗糠柴霉素组和粗糠柴霉素+pcDNA组相比，粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6组的PAK6蛋白表达量显著升高(见图4)。

MTT和流式细胞术实验结果表明，粗糠柴霉素组细胞抑制率和凋亡率均显著高于对照组(P<0.05)；粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6组细胞抑制率和凋亡率均显著低于粗糠柴霉素+pcDNA组(P<0.05)(见表4)。

图4 A549细胞中的PAK6蛋白过量表达

表4 PAK6过表达逆转了粗糠柴霉素对肺癌细胞A549增殖、凋亡的作用

六、PAK6过表达逆转了粗糠柴霉素对A549的放射增敏作用

克隆形成实验表明，与对照组相比，随着照射剂量的增加，粗糠柴霉素组A549的细胞存活分数逐渐下降，且差异显著(P<0.05)；与粗糠柴霉素+pcDNA组相比，粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6组的细胞存活分数显著升高(P<0.05)(见图5)。说明PAK6过表达逆转了粗糠柴霉素对A549的放射增敏作用。

图5 不同剂量照射后A549细胞的存活曲线

讨 论

肺癌位居世界癌症首位，非小细胞肺癌占肺癌患者85%左右，多数患者确诊时已为肺癌晚期，失去了手术根除的最佳治疗机会，所以肺癌的发病率和死亡率接近，目前，手术治疗、放射、化疗和分子靶向药物治疗是肺癌的最主要治疗方式[1]。

粗糠柴霉素被众多研究证实，对乳腺癌[3]、前列腺癌[4]、肝细胞癌[5]、胃癌[6]、非小细胞肺癌[7]有抗肿瘤作用，本研究证实了粗糠柴霉素在适当浓度抑制非小细胞肺癌细胞增殖的作用，证实粗糠柴霉素对非小细胞肺癌具有潜在的临床抑制作用。

柯蒙等研究表明，粗糠柴霉素通过下调低密度脂蛋白相关受体6(LRP6)抑制前列腺癌细胞PC-3的经典Wnt通路，实现抑制肿瘤发展的目的[4]。Yin等研究乳腺癌时，得出结论：粗糠柴霉素通过抑制S 期激酶相关蛋白 2(S-phase kinase associated protein 2，SKP2)表达，达到抑制乳腺癌的目的[3]。Zhao 等人发现粗糠柴霉素通过抑制 Hippo 通路中TAZ蛋白的表达，达到抑制非小细胞肺癌的作用[7]。本研究结果发现粗糠柴霉素是通过抑制PAK6表达来促进A549凋亡，抑制非小细胞肺癌细胞增殖的。本研究结果与上述研究结论相似，都表明粗糠柴霉素是通过下调癌细胞中某些信号通路蛋白表达，来发挥增殖抑制和凋亡促进的功能。蔡松旺发现，PAK6 通过重构细胞骨架抑制非小细胞肺癌的侵袭及迁移能力[12]；本研究结果与蔡松旺的结果互补，同时证实了PAK6是通过抑制细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡，进而达到抑制非小细胞肺癌的作用。本研究还发现，粗糠柴霉素可以作为非小细胞肺癌潜在的放射增敏剂。

Brahma 等发现粗糠柴霉素可诱导胰腺癌干细胞自噬导致细胞死亡[13]。QI等人研究发现，粗糠柴霉素通过阻滞细胞周期，同时产生大量内源性微管相关蛋白 1 轻链3(LC3)-II 蛋白以及自噬小体，通过诱导细胞发生自噬促进膀胱癌细胞的凋亡[14]。Wnt通路在生长发育和疾病发生过程中具有重要的作用，与各种癌症的发生和发展更是密切相关[15-17]。PAK6可能通过Wnt通路和/或Hippo 通路影响A549的增殖、侵袭、凋亡，而粗糠柴霉素可能通过调节PAK6表达来影响Wnt通路和/或Hippo 通路，从而抑制细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡或产生细胞自噬，最终达到抑制非小细胞肺癌的作用。这些作用并不是通过单个信号通路或分子标靶来实现的，多个分子机制的参与，使这一过程的研究充满了挑战，也为粗糠柴霉素成为临床抗肿瘤药物奠定了理论基础。下一步将从这几个方向着手研究粗糠柴霉素影响非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭、凋亡的分子机制，探讨粗糠柴霉素作为潜在的放射增敏剂在抑制非小细胞肺癌中的作用机制。