miR-17-5p在肺结核患者外周血中表达变化及临床意义

汤志森 王德志

肺结核是临床常见的慢性传染性疾病，主要由结核分枝杆菌感染引起，是引起人类死亡率升高的主要传染病之一[1]。在世界范围内，每年大约有1000万例以上的肺结核新发病例及140万例以上的肺结核死亡病例，在国内每年死亡人数达12万，严重威胁人类健康[2-3]。研究发现，部分病人感染结核分枝杆菌后并非立即发病，直到机体免疫力下降或变态反应增强后，才表现出肺结核症状[4]。而数据显示，国内有近一半的人感染结核分枝杆菌，及时诊断肺结核及其活动性并及时治疗具有重要意义[5]。目前肺结核临床诊断方法有细胞因子检测、细菌学检测、抗原检测等，但因耗时长、对样品要求高及可能出现假阴性等缺点，难以准确诊断肺结核病情从而延误治疗。因此，寻找与肺结核发病相关的基因，快速准确的判断肺结核发病及其病情，对肺结核治疗具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种非编码小RNA分子，长约20～25个核苷酸，参与多种疾病生理、病理过程[6]。近年来研究发现，miRNA不仅在传染性疾病的发生发展中发挥重要作用，且在结核病病人外周血中稳定存在，已作为新的生物标志物成为结核病研究热点[7-8]。目前有研究证实，miR-17-5p在调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的炎症反应中发挥重要作用[9]，但在肺结核患者体内的表达尚鲜有研究。本研究将检测肺结核患者外周血miR-17-5p水平，并探讨其临床意义。

资料与方法

一、一般资料

选取2017年10月至2019年8月在本院就诊的肺结核患者(肺结核组)86例作为研究对象。根据肺结核活动性，将肺结核患者分为非活动性肺结核组(33例)和活动性肺结核组(53例)。选取同期进行体检的健康者(对照组)90例作为对照，肺结核组和对照组性别、年龄、体质指数(body mass index，BMI)比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

纳入标准：(1)肺结核及其活动性诊断符合中华人民共和国卫生行业标准《肺结核诊断》及《结核病分类》[10-11]。(2)临床资料完整，且受试者依从性高。(3)受试对象知情同意，并签署有关证明文书。

表1 患者一般资料比较

排除标准：(1)合并脏器损害者。(2)合并恶性肿瘤者。(3)合并全身免疫相关性疾病者。(4)合并其他肺部疾病者。

二、试剂与仪器

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(货号：EX1882-50T、RE0510-100T)购自金克隆(北京)生物技术有限公司；miScript SYBR Green PCR kit(货号：218076)购自德国QIAGEN公司；人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(货号：SEKH-0047、SEKH-0013)及miR-17-5p、U6引物购自北京索莱宝科技有限公司。

Rotor-Gene®Q实时荧光定量PCR仪购自美国QIAGEN公司；SPECTRAmaxM2e型酶标仪购自美国Molecular Devices公司。

三、血液采集

肺结核患者入院第2日晨起抽取肘部空腹静脉血，对照组体检当日抽取肘静脉血，4℃ 3000 r/min离心10 min，取上层血清，分装、在-80℃冰箱中保存待用。

四、实时荧光定量PCR法测定外周血miR-17-5p表达水平

将保存于-80℃冰箱的血清样本200 μL取出，于冰上融化，使用RNA提取试剂盒并按照其说明书抽取总RNA，测定其浓度、纯度、完整性后使用反转录试剂盒并按照其说明书将总RNA反转录为cDNA，-80℃保存。使用miScript SYBR Green PCR kit并按照其说明书配制实时荧光定量PCR反应体系，在实时荧光定量PCR仪上反应40个循环。以管家基因U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法表示miR-17-5p表达水平。miR-17-5p上游引物：5′-GCCGCAAAGTGCTTACAGTG-3′，miR-17-5p下游引物：5′-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6上游引物：5′-CAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′，U6下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。

五、ELISA法检测外周血炎症因子水平

将保存于-80℃冰箱的血清样本200 μL取出，于冰上融化，分别使用人TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒，按照其说明书进行操作，用酶标仪测定吸光度(optical density，OD)值，绘制标准回归曲线，计算TNF-α、IL-6表达水平。

六、统计学分析

结 果

一、肺结核组与对照组外周血miR-17-5p表达水平

与对照组相比，肺结核组患者外周血miR-17-5p表达水平显著升高(P<0.05)(见表2)。

表2 肺结核组与对照组外周血miR-17-5p表达水平比较

二、肺结核组与对照组外周血炎症因子表达水平

与对照组相比，肺结核组患者外周血TNF-α、IL-6表达水平显著升高(P<0.05)(见表3)。

表3 肺结核组与对照组外周血TNF-α、IL-6表达水平比较

三、肺结核患者外周血miR-17-5p表达水平与炎症因子的相关性

相关性分析结果显示，肺结核患者外周血miR-17-5p表达水平与TNF-α、IL-6均呈显著正相关(r=0.524、0.595，P<0.05)(见图1)。

四、活动性与非活动性肺结核患者外周血miR-17-5p表达水平

与非活动性肺结核组相比，活动性肺结核组患者外周血miR-17-5p表达水平显著升高(P<0.05)(见表4)。

表4 活动性与非活动性肺结核患者外周血miR-17-5p表达水平比较

五、外周血miR-17-5p表达水平对肺结核及其活动性的诊断价值分析

ROC曲线分析结果显示，外周血miR-17-5p表达水平区分肺结核患者与健康者的ROC曲线下面积为0.905(95%CI：0.861～0.949)，约登指数为0.684，当诊断阈值为1.365时敏感度为88.4%，特异性为80.0%，见图2；外周血miR-17-5p表达水平区分活动性肺结核患者与非活动性肺结核患者的ROC曲线下面积为0.756(95%CI：0.681～0.831)，约登指数为0.397，当诊断阈值为1.555时敏感度为48.8%，特异性为90.9%(见图3)。

图1 肺结核患者外周血miR-17-5p表达水平与TNF-α、IL-6的相关性分析图

图2 ROC曲线分析外周血miR-17-5p表达水平对肺结核的诊断价值

图3 ROC曲线分析外周血miR-17-5p表达水平对肺结核活动性的诊断价值

讨 论

结核病是全世界面临的公共卫生问题，是现今人类3大感染性疾病之一，其死亡率位于传染病榜首。每年均有大量人群感染结核分枝杆菌，发展为慢性炎症疾病，通常以肺结核病居多。流行病学显示，全球肺结核病人的数量每年以数百万的速度增加，防治形势仍非常严峻，发病成为活动性肺结核后可导致死亡率大大增加[12]。因此，及时诊断肺结核及其活动性具有重要临床价值。

近年来，miRNA已被发现广泛参与细胞各种生物学行为及各种生理、病理反应的调控，包括微生物感染后机体的免疫应答、炎症等反应。研究发现，宿主被结核分枝杆菌感染后，巨噬细胞表面的Toll样受体可识别病原体，引发炎症反应及多种免疫防御机制，进而清除入侵的结核分枝杆菌[13]。而在结核分枝杆菌感染的过程中，巨噬细胞产生的特异性miRNA，可在肺结核病人血液中被检测到。因此，在结核患者体内差异表达的miRNA，可能参与巨噬细胞调控的炎症反应、免疫防御过程，有潜力成为诊断结核病及其病情的生物标识。康雪雪等[14]研究表明，hsa-miR-17-5p在哮喘儿童血清中高表达，其机制可能与炎症、免疫有关，有望成为诊断哮喘的标志物。张苹等[15]研究表明，丙型肝炎患者血清hsa-miR-17-5p相对表达量显著升高，与丙型肝炎病毒感染及致病密切相关，有望成为丙肝患者肝损伤判断的潜在分子标志物。而张帆等[9]研究发现，结核分枝杆菌感染可下调miR-17-5p表达，而miR-17-5p可通过靶向抑制SIRPα表达，上调细胞因子TNF-α表达，进而调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌的炎症反应。洪丹彤等[16]从自噬角度亦发现，miR-17-5p在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染过程中发挥重要作用。本研究结果显示，肺结核组患者外周血miR-17-5p表达水平较对照组显著升高，提示miR-17-5p参与肺结核的发生过程。肺结核组患者外周血TNF-α、IL-6表达水平较对照组显著升高，同时肺结核组患者外周血miR-17-5p表达水平与外周血TNF-α、IL-6表达水平呈显著正相关，提示肺结核患者体内miR-17-5p的表达与炎症反应密切相关，并推测miR-17-5p水平升高可能是机体的内源保护反应，可能促进TNF-α、IL-6表达，调控肺结核患者体内炎症反应，进而清除感染的结核分枝杆菌。

由于miRNA在血液等临床样本中稳定性高，可以快速准确定量，有望成为反映疾病发生发展的生物学指标。侯新月等[2]研究显示，miR-24-3p区分肺结核患者与健康体检者的敏感度、特异度分别为86%和90%。本研究使用外周血miR-17-5p表达水平诊断肺结核的敏感度、特异性分别为88.4%、80.0%，提示外周血miR-17-5p表达水平对肺结核具有较高的诊断价值。肺结核的活动性，关系到患者的治疗措施，及时诊断肺结核活动性对肺结核患者治疗至关重要[17]。本研究结果显示，活动性肺结核组患者外周血miR-17-5p表达水平较非活动性肺结核组显著升高，提示外周血miR-17-5p表达水平与肺结核患者活动性密切相关。侯新月等[2]研究显示，miR-24-3p区分活动性肺结核患者与非活动性肺结核患者的敏感度、特异度分别为53.3%和100%。周冰等[5]研究表明，miR-144区分活动性肺结核患者与健康志愿者的敏感度、特异度分别为96.88%和96.77%。本研究使用外周血miR-17-5p表达水平诊断肺结核患者活动性的敏感度、特异性分别为48.8%和90.9%，提示外周血miR-17-5p表达水平诊断肺结核患者活动性的特异性较好，具有一定临床参考价值。

综上所述，miR-17-5p在肺结核患者外周血中高表达，在活动性肺结核患者外周血中表达更高，其水平与炎症因子TNF-α、IL-6水平明显相关，可用于辅助诊断肺结核及其活动性。