豫北地区结核分枝杆菌临床分离株基因型及四种二线药物耐药性分布的分析

朱增红 张会强 屠永凯 叶鹏 赵顺现 宋庆芳 王红民

世界卫生组织(WHO)全球结核病报告证实每年新发耐药性结核病人数达56万，而我国是公认结核病特别是耐多药结核病高负担国家[1]。近年来随着耐多药结核菌株感染比例增加，二线抗结核药物获得大量使用，而这进一步导致结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)菌株对于此类抗结核药物耐药形成[2]。目前研究认为东亚地区MTB基因型以北京型为主，该型菌株流行传播往往与一线抗结核药物耐药性形成无关[3]；有学者报道认为北京型MTB菌株基因突变率更高、较易出现异烟肼、利福平、链霉素及乙胺丁醇耐药，治疗失败风险亦显著提高[4]。但亦有不同观点认为北京型MTB菌株异烟肼耐药比例较其他型更低[5]。本次研究纳入豫北地区(安阳、鹤壁、濮阳、新乡、焦作等五地区)2019年收治肺结核患者痰涂片检出MTB菌株共2280株，均行MTB基因型鉴定，分析纳入患者一般资料和风险因素，目的在于探讨豫北地区结核分枝杆菌临床分离株基因型及四种复治药物耐药性分布，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

本次回顾性纳入豫北地区2019年收治肺结核痰涂片阳性培养标本中MTB菌株共3920株，完成基因分型鉴定和药敏试验检查分别为2910株、2716株，两者同时拥有者2296株，剔除资料重复菌株16株，最终纳入2280株进行研究。纳入标准：①在豫北地区确诊肺结核；②痰涂片结核杆菌阳性；③年龄≥18岁；排除标准：①基因分型结果不完整；②药敏试验结果不完整；③MTB分离失败。

二 、方法

1 基因分型：采用间隔区寡核苷酸法完成基因分型，由培养细菌提取基因组DNA，依据直接重复位点完成基因型识别；采用DRa和DRb引物完成全部菌株直接重复区扩增；将扩增产物和含间隔区寡核苷酸探针生物素C膜进行杂交，通过化学发光法完成杂交信号检测；检测结果对比SpolDB4数据库。

2 药敏试验：药敏试验根据严格依据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)流程及操作标准完成[6]，采用微孔板法完成分枝杆菌药敏试验，以H37Rv株为对照，二线抗结核药物种类包括左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素及对氨基水杨酸，含药培养基中浓度分别为2 mg/L，30 mg/L，2 mg/L，40 mg/L；如样本菌株与对照菌株相比生长速度>1%时则判定为耐药；其中耐多药判定标准为患者至少对异烟肼和利福平同时耐药。

三、统计学方法

选择SPSS20.0软件分析数据；计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，以%表示；采用Cox比例风险模型计算HR(95%CI)；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料和风险因素分析

2280株MTB菌株中北京和非北京型MTB菌株分别为1882株，398株；Cox比例风险模型分析以基因型情况作为因变量，一般资料指标作为自变量，分析结果显示北京和非北京型MTB中，性别、≥65岁比例及户籍情况比较，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 一般资料和风险因素分析

二、MTB基因型与二线抗结核治疗耐药性间相关性分析

北京和非北京型MTB菌株中无耐药和耐多药比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)；北京型MTB菌株耐左氧氟沙星、耐阿米卡星、耐卷曲霉素及耐对氨基水杨酸比例均显著低于非北京型MTB菌株(P<0.05)(见表2)。

表2 MTB基因型与二线抗结核治疗耐药性间相关性分析

讨 论

目前研究证实国内流行MTB菌株基因型以北京型为主；深入细致了解MTB菌株分子流行病学特点对于防治结核病具有重要意义。本次研究纳入2280株MTB菌株中，北京和非北京型MTB菌株分别为1882株、398株；其中北京和非北京型MTB中性别、≥65岁比例及户籍情况比较差异有统计学意义，提示豫北地区流行MTB基因型主要为北京型，且男性、中青年及流动人口中比例更高，与以往报道结果相符[7]。男性较女性社交更为广泛频繁，流动人口所处居住环境，因人口密度高、拥挤等因素导致北京型更易出现传播[8]。

以往报道MTB菌株基因型中北京型流行与耐药性关系多集中在一线抗结核药物间，而对于二线抗结核药物耐药性关注相对较少。本次研究针对豫北地区MTB菌种中北京型流行情况及与二线抗结核药物耐药性间关系，进行分析，结果显示北京型MTB菌株耐左氧氟沙星、耐阿米卡星、耐卷曲霉素及耐对氨基水杨酸比例均显著低于非北京型MTB菌株(P<0.05)，表明豫北地区北京型MTB流行并未导致二线抗结核药物耐药性增强。但既往研究认为[9]，北京型与非北京型MTB菌株间氧氟沙星耐药比例比较，差异无统计学意义，同时rrs基因A1401G替换比例亦接近。已有研究显示[10]，rrs基因A1401G替换是导致MTB菌株抗阿米卡星形成最常见突变。本次研究显示北京型MTB菌株对于阿米卡星耐药比例更低，证实其他基因表达差异，可能亦在其中发挥着重要作用。笔者查阅文献注意到不同地区MTB基因型差异对阿米卡星耐药性影响研究结果明显差异，这可能与各个地区间存在不同亚系和个别菌株分类有关，仍有待后续研究进一步确证。

本次研究结果中，北京和非北京型MTB菌株中耐多药比例比较，差异无统计学意义，提示豫北地区耐多药结核发生与MTB菌株基因型无关，与早期报道结果相符[11]。但亦有多项研究认为耐多药菌株流行与MTB北京型密切相关[12-13]；以上研究进一步证实不同地区不同菌株间亚型，可能导致最终结论受影响。

尽管MTB菌株中北京型在我国流行最为广泛，但各个地区间亦存在明显亚系和个别菌株分类差异，从而导致耐药性特点存在差异[14]。部分学者研究认为不同时期北京型菌株间存在明显多态性特征差异，其中目前基因型菌株与毒力相关基因多态性突变更为普遍；此外不同地区北京型亚型和亚系差异，亦可干扰MTB治疗药物耐药性[15]。

本次研究仅初步探讨MTB菌株北京型与二线抗结核药物耐药性间关系，缺乏更为深入明确分子层面机制。现有研究认为MTB菌株北京型蛋白质和糖脂代谢，存在自身特征，推测以上改变可能影响自身耐药性及传播能力[16]。

综上所述，豫北地区MTB菌株以北京型为主，且男性和非本市户籍人口更为常见；同时非北京型菌株更易出现左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素及对氨基水杨酸耐药。