京尼平调节Nrf2/HO-1通路抑制ARPE-19细胞氧化损伤

董 威 刘犇龙 师 岩 陈庆友 徐文双 贾 迪 徐 晶

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者常见眼部并发症，在持续高血糖和部分毛细血管闭塞环境中易受氧化应激损伤，其中视网膜色素上皮细胞作为视网膜外屏障耗氧多，产生大量氧自由基及活性氧，会直接损伤功能细胞，与DR的发病密切相关[1]。因此抗氧化治疗成为防治DR的一个有效途径。已经证明栀子提取物京尼平，能防治多种发病机制与氧化应激损伤有关的疾病，例如抑制高血糖诱导的心肌细胞损伤，缺血再灌注引起的心肌细胞氧化应激损伤，能有效保护肝细胞氧化应激损伤，减轻脊髓小脑神经细胞氧化应激损伤等作用[2～5]。但京尼平在糖尿病视网膜病变中能否发挥作用的报道较少，根据文献建立高糖缺氧环境的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)氧化损伤模型，观察京尼平对于ARPE-19细胞氧化损伤的作用，并探讨相关机制[6]。

材料与方法

1.材料：人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞株，上海生命科学院细胞资源中心)，Genipin和Nrf2抑制剂ML385(美国Sigma公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，DMEM/F12培养基(美国HyClone公司)，ROS检测试剂盒、GSH-Px检测试剂盒和AO/EB双染试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Nrf2、HO-1和β-actin抗体(美国Cell signaling technology公司)，山羊抗兔抗体(武汉博士德生物公司)。

2.ARPE-19细胞培养和分组：10%胎牛血清的DMEM/F12 培养液，加入1% 青-链霉素混合液，在37℃，5% CO2细胞培养箱中培养，2～3天传代一次，细胞生长近70% 融合时，换用无血清培养液12h后分组培养：对照组(加入5.5mmol/L浓度葡萄糖)、模型组(加入25mmol/L高浓度葡萄糖和150μmol/L CoCl2模拟体外高糖和缺氧环境)、京尼平组(10μmol/L京尼平预处理4h后加入25mmol/L高浓度葡萄糖和150μmol/L CoCl2)、Nrf2抑制剂组(10μmol/L京尼平和Nrf2 抑制剂2μmol/L ML385 预处理4h后加入25mmol/L高浓度葡萄糖和150μmol/L CoCl2)。

3.ARPE-19细胞形态学观察：将细胞接种于6孔板，每孔1×104个细胞密度，分组培养72h 后，弃培养基，PBS 清洗2次后，40g/L多聚甲醛固定10min后，倒置相差显微镜下观察并拍照。

4.吖啶橙-溴乙锭染色法检测细胞凋亡：细胞处理方法同上。按照试剂盒操作，6孔板中每孔加100μl Buffer稀释液，每孔再加5μl吖啶橙和5μl溴乙锭，混匀，室温避光孵育5min后，弃上清，PBS洗两次，荧光显微镜下观察，Image J软件对图片细胞计数。

5.细胞内氧化应激水平测定：按照每孔2×104个细胞接种于96孔板，分组培养72h后。DCFH-DA法检测ROS含量，根据活性氧测定试剂盒说明书各组取100μl细胞悬液，加入10μmol/L的DCFH-DA，每孔100μl，37℃避光孵育30 min后，消化后收集细胞沉淀，预冷PBS重悬细胞，酶标仪525nm波长检测吸光度(A)值，计算ROS水平。按照GSH-Px检测试剂盒说明书的反应体系每组200μl细胞悬液中依次加入GSH标准品应用液和标准液，混匀，室温静置15min,412nm波长测定每间隔2min时的A值，根据标准曲线计算细胞内GSH-Px活力。

6.Western blot法检测京尼平对细胞中Nrf2/HO-1通路蛋白的影响：对数生长期ARPE-19细胞接种到100mm培养皿，加入10ml培养基，1×105个/毫升密度分组培养72h，提取各组总蛋白，蛋白定量后，每孔以20μg样品上样，电泳浓缩胶75V、30min，分离胶110V、60min，4℃转膜100min，5% 脱脂奶粉室温封闭90min，加入抗β-actin、Nrf2和HO-1抗体(浓度均为1∶1000)，4℃孵育过夜，1∶5000的二抗37℃孵育1.5h，ECL化学发光显色，Image J凝胶图像分析各蛋白相对表达量。

结 果

1.倒置显微镜下观察京尼平对ARPE-19细胞形态影响:正常糖对照组的 ARPE-19 细胞呈长梭形，单层伸展贴壁生长，镶嵌式排列，边界清晰，形态规整，分布均匀，状态良好(图1A)；模型组细胞梭形扭曲改变，部分缩小变圆，边界不清，镶嵌式排列杂乱，细胞密度较低，生长状态不佳(图1B)；京尼平组圆形皱缩细胞明显少于模型组，改善了细胞形态(图1C)；抑制剂组形态异常细胞较模型组少(图1D)。

图1 倒置显微镜下观察各组ARPE-19细胞形态(×100)A.对照组；B.模型组；C.京尼平组；D.抑制剂组

2.AO/EB染色法检测细胞凋亡：空白对照组细胞呈均匀绿色荧光；模型组红色荧光逐渐增强，合并后的图像可见橘红色荧光增加，细胞密度也出现了减少；京尼平组细胞形态接近对照组，细胞数量增加，红色荧光变弱，合并后也呈较弱的橘红色荧光，抑制剂组橘红色荧光比模型组减弱。根据橘红色荧光染色的细胞比例计算细胞凋亡率(图2)。

图2 吖啶橙-溴乙锭染色观察各组细胞形态学变化与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与京尼平组比较，**P<0.05

3.京尼平对细胞内氧化应激水平的影响：与正常糖对照组比较，模型组由高糖和缺氧诱导损伤产生ROS水平明显增加，GSH-Px活力降低(P<0.05)。与模型组比较，京尼平组ROS水平显著降低，GSH-Px活力增加(P<0.05)，而抑制剂组比京尼平组ROS水平增加，GSH-Px活力下降(P<0.05，表1)。

表1 京尼平对各组ARPE-19细胞ROS水平和GSH-Px活力的影响

4.京尼平对各组细胞Nrf2和HO-1蛋白表达的影响：模型组细胞中Nrf2和HO-1蛋白水平低于对照组；京尼平组Nrf2和HO-1蛋白水平高于模型组；而抑制剂组与京尼平组比较降低，差异均有统计学意义(P<0.05，图3、表2)。

图3 京尼平对各组ARPE-19细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

表2 京尼平对各组ARPE-19细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

讨 论

DR是糖尿病患者常见易发的微血管病变，主要特征是高糖环境和部分微血管闭塞导致缺氧，其病理改变过程中与细胞氧化损伤密切相关[7,8]。抑制视网膜色素上皮细胞(ARPE)氧化应激损伤，研究天然有效抗氧化剂成为防治DR的一个新途径。京尼平是传统中药栀子、杜仲等植物中提取的有效抗氧化剂，是一种特异的羟基清除剂，能有效清除活性氧和自由基，具有多重抗氧化应激和保护线粒体功能的作用，已经证明在防治糖尿病并发症相关的神经系统损害、心肌病变、肾病及心血管系统疾病等多种病症中，可以发挥抗氧化应激保护作用[9～12]。

体外模拟DR相似的病理环境，建立高糖缺氧的ARPE-19细胞氧化损伤模型，分析京尼平对细胞的抗氧化损伤作用和机制。利用倒置显微镜观察到模型组细胞密度小，生长状态差，京尼平组明显改善了高糖缺氧环境的细胞形态。通过AO/EB染色检测到模型组橘红色荧光明显增强，细胞凋亡率明显上升，京尼平组的细胞凋亡率却明显下降，说明京尼平可以抑制细胞凋亡。ROS是含氧活性分子的总称，对调节细胞氧化还原稳态、免疫应答及信号传递等有重要调节作用，细胞在正常生理状态下释放较少[13,14]。氧化还原系统失衡时生成大量ROS，过多会破坏线粒体呼吸链引起细胞能量代谢障碍，促进细胞凋亡，是细胞氧化应激损伤的标志性事件。GSH-Px是细胞内调节氧化还原平衡状态的重要内源性抗氧化酶，能解除过氧化物毒性，分解过氧化氢[15]。

本实验检测到模型组细胞在高糖缺氧的环境下ROS含量明显增强，GSH-Px活力下降，京尼平处理后ROS含量则明显下降，GSH-Px活力增大，说明京尼平对氧化应激损伤的细胞具有明显的保护作用。细胞抗氧化系统失衡会促进凋亡调控信号因子的合成和释放，其中Nrf2是内源性氧化应激通路的重要调节因子，在维持氧化还原平衡方面担任主要的角色[16]。正常状态时，Nrf2在细胞质内与Keap-1结合，在氧化应激状态时，活化Nrf2，与Keap-1解离，进入细胞核，与抗氧化剂反应元件(ARE)结合，调控下游抗氧化蛋白HO-1，催化血红蛋白降解，形成内源性抗氧化保护系统，减弱氧化应激，同时抑制促凋亡蛋白酶[17]。本研究发现，京尼平能增加缺氧和高糖环境中细胞质内Nrf2和HO-1的表达量，而加入Nrf2抑制剂后细胞质内Nrf2和HO-1却明显降低，说明一定浓度的京尼平可以通过调节Nrf2/HO-1信号通路维持氧化还原状态的平衡，减少氧化应激损伤，为抗氧化剂防治糖尿病视网膜病提供理论基础。