基于正交设计的姬松茸母种培养条件优化

张琴,成文竞

基于正交设计的姬松茸母种培养条件优化

张琴,成文竞*

上海农林职业技术学院, 上海 201699

姬松茸（Murrill）是一种药食同源食用真菌，其味道鲜美，别具香味，且其子实体内富含多种氨基酸、脂肪、矿物质、纤维素及微量元素等人体必需的营养成分，经常食用还具有提升机体免疫力，延缓衰老等保健功效。本研究以姬松茸母种JS05为试验材料，考察温度、光照、pH值和不同培养基对菌丝生长速度的影响，结果表明：24～30 ℃是菌株生长的最适温度范围，菌丝生长速度较高，其中在27 ℃条件下菌丝的生长速度最高，达到4.6 mm·d-1；当培养基pH值为6时，菌丝的生长速度最高；在黑暗条件下，菌丝的生长速度较高；马铃薯培养基比玉米粉培养基更适合菌丝生长。正交试验结果表明：采用加富培养基在培养温度为27 ℃，pH值为6的条件下，菌丝生长速度最高；pH值是影响姬松茸母种菌丝生长的最关键因素，在母种培养时应着重加以注意。

姬松茸; 菌种培养; 条件优化

随着生活水平的提高，人们越来越喜爱食用营养丰富，安全性好的菌菇类蔬菜。姬松茸原产巴西，又名巴西菇，是一种药食同源食用真菌，其味道鲜美，别具香味，且其子实体内富含多种氨基酸、脂肪、矿物质、纤维素及微量元素等人体必需的营养成分，经常食用还具有提升机体免疫力，延缓衰老等保健功效[1-3]。前人对姬松茸的营养价值进行了较多研究，有很多研究都表明从姬松茸中提取的活性物质对肿瘤有一定的防治作用，可以用于研制抗癌药，能促进免疫细胞增殖，活化产生刺激因子，破坏癌细胞活性，提高身体抗癌能力[4]。作为一种珍稀食药用菌，姬松茸的发展前景十分广阔。

姬松茸（Murrill）为真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属，是一种草腐型、喜湿、好氧的菌类。其子实体菌盖呈扁圆形到半球形，菌盖表面密覆淡褐色至栗褐色纤维状鳞片，盖缘有菌幕的碎片；姬松茸菌肉呈白色，菌褶密布离生，菌柄圆柱形中实，菌环白色、膜质，孢子暗褐色椭圆至球形，无芽孔，菌丝没有锁状联合[5-8]。优良菌种是姬松茸栽培生产的关键生产资料，在菌种的继代培养过程中，常常会出现菌丝生长速度减小，产量下降，抗逆性下降等退化现象，导致后续生产遭受不可避免的损失。前人对姬松茸培养基的筛选进行了一些研究，但尚未系统对姬松茸的培养条件进行优化研究。由于常规姬松茸母种一般采用PDA培养基斜面保藏法，此法虽然具有简单易行，无需专门的设备，并方便实时观察菌种生长情况的优点，但存在培养基不适合长期保藏菌种，易导致菌种的正常生理代谢途径受到抑制，进而导致菌种的变异或者退化的问题[9-12]。因此，优化姬松茸母种的培养条件，避免母种在保存培养的过程中过早地发生退化或者变异的情况，有助于姬松茸生产的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为姬松茸菌株JS05，为本实验室保存的菌种材料，通过菌株无性分离法（即组织分离法）获得。供试磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）为天津市化学试剂六厂生产；硫酸镁（MgSO4·7H2O，分析纯）为天津市天河化学试剂厂生产；供试葡萄糖、蔗糖、琼脂、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等为东北制药厂生产；供试马铃薯和玉米粉等为市售。主要采用的仪器设备有恒温培养振荡器、生化培养箱和光照培养箱等。

供试基础培养基为PDA培养基，其配方为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1000 mL，pH值自然。

1.2 方法

将姬松茸菌株JS05接种到PDA琼脂培养基，室温下纯化培养。将纯化后的菌株在室温下活化24 h，然后接种到PDA试管斜面培养基，在室温下恒温培养。

1.2.1 不同温度对姬松茸菌丝生长的影响将JS05菌株接种到30 mL的PDA培养基上，分别在15，18，21，24，27，30，33，36 ℃条件下培养5 d后，考察不同培养温度对姬松茸菌株生长速度的影响，每个温度处理设3次重复。

1.2.2 不同光照条件对姬松茸菌丝生长的影响将JS05菌株接种到30 mL的PDA培养基上，设置光照培养箱的光照强度分别为0，5，10，15，20，25，30 lx，培养5 d后调查姬松茸菌丝的生长速度，考察不同光照强度对姬松茸菌丝生长的影响，每个光照强度处理设3次重复。

1.2.3 不同pH值对姬松茸菌丝生长的影响将JS05菌株接种到30 mL的PDA培养基上，采用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NAOH调节培养基的pH值，设置培养基pH值分别为3，4，5，6，7，8，9和10，考察培养基不同pH值对姬松茸菌丝生长速度的影响，每个pH处理设3次重复。

1.2.4 不同培养基组成对姬松茸菌丝生长的影响 PDA琼脂培养基的制作方法是将去皮马铃薯加水后加热约30 min，用纱布过滤取得滤液，向滤液加入20 g琼脂后，加热搅拌直至琼脂完全溶解，加水定容至1000 mL。加富PDA培养基的制作方法是将去皮马铃薯和麸皮加水后煮沸约30 min，用纱布过滤取得滤液，向滤液中加入20 g琼脂后，加热搅拌直至琼脂完全溶解，最后加水定容至1000 mL。PDA综合培养基的制作方法是在PDA琼脂培养基的基础上，向培养基中加入KH2PO4（2 g）、MgSO4·7H2O(0.5 g)。玉米粉培养基的制作方法是将玉米粉（80 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（40 g）用2 L水加热溶解混匀[13]。

将JS05菌株接种到30 mL供试培养基上，26 ℃在黑暗条件下培养5 d后测定菌丝长度，计算菌丝生长速度，考察不同培养基组成对姬松茸菌丝生长的影响，每个培养基处理设3次重复。

1.2.5 正交试验设计法优化姬松茸母种培养条件根据单因素实验结果，采用L9（33）正交试验设计[14]，考察不同培养温度、pH值和培养基组合对姬松茸母种菌丝生长的影响，优化姬松茸母种培养条件。各因素水平详见表1。

表 1 L9（33）正交试验设计因素水平

2 结果与分析

2.1 不同培养温度对姬松茸菌丝生长的影响

由图1可知，不同培养温度条件下，姬松茸菌株的菌丝生长速度不同。24～30 ℃是菌株生长的最适温度范围，菌丝生长速率较高，其中在27 ℃条件下菌丝的生长速度最高，达到4.6 mm·d-1。当培养温度小于21 ℃，菌丝生长速度明显降低，随着培养温度的降低，菌丝生长速度逐渐减小，15 ℃时，菌丝的生长速度最小。培养温度超过33 ℃时，菌丝生长速度明显降低。

图1 不同培养温度对姬松茸菌丝生长的影响

2.2 不同pH值培养基对姬松茸菌丝生长的影响

由图2可知，随着培养基pH值的不断增加，姬松茸菌丝生长速度呈先增加，后降低的变化趋势。当培养基pH值为6时，菌丝的生长速度最高，达到4.5mm·d-1。pH值小于5，大于7时，菌丝生长速度出现明显下降。

图 2 不同pH值对姬松茸菌丝生长的影响

2.3 不同光照条件对姬松茸菌丝生长的影响

由图3可知，在黑暗条件下，姬松茸菌丝生长速度最快，达到4.1 mm‧d-1。随着光照强度的升高，姬松茸菌丝生长量呈逐渐下降的趋势，当培养光照为30 lx时，姬松茸菌丝的生长速度降到1.2 mm‧d-1，仅为黑暗条件下姬松茸菌丝生长速度的29%。

图3 不同光照条件对姬松茸菌丝生长的影响

2.4 不同培养基对姬松茸菌丝生长的影响

由表2可知，在马铃薯培养基上姬松茸母种菌丝生长较好，在玉米粉培养基上菌丝生长较弱。在马铃薯培养基中，PDA综合培养基处理的菌丝生长速度最大，菌丝长度最长；加富PDA培养基处理的菌丝生长速度次之，两者差距并不大。3个马铃薯培养基处理的菌落形态均表现为菌丝浓密。

表 2 不同培养基对姬松茸菌丝生长的影响

2.5 姬松茸母种培养条件的正交试验设计法优化

通过正交试验设计结果分析可知（表3），姬松茸母种培养的较优条件组合为A2B2C2，即采用加富培养基在培养温度为27 ℃，pH值为6的条件下，菌丝生长速度最高。不同因素影响大小依次为：B（pH值）＞A（温度）＞C（培养基）。

表 3 姬松茸母种培养条件的正交试验结果分析

3 讨论与结论

姬松茸是一种适宜生活在高温、多湿和通风环境中的腐生菌。姬松茸具有杏仁的香味，不仅口感脆嫩，菌柄脆、菌盖嫩、口感极好，而且其药用价值和营养价值都极高，尤其是具有较强的抗癌作用，是一种食药兼用的保健菇。前人研究表明，姬松茸含有至少17种常见的氨基酸，其中人体必需氨基酸占近一半。姬松茸新鲜子实体粗蛋白含量较高（54.32%，以干重计），干制后含量虽略有下降，但差异不大[15]。姬松茸中还含有人体必需的多种常量元素和微量元素，如钙、镁、磷和锌、铁、锰、铜等[16]。姬松茸提取物（ABE）通过激活ROS/JNK介导的线粒体途径和抑制核因子活化而诱导人白血病THP-1细胞凋亡[17]。适宜的环境条件是菌种进行正常生理代谢活动、合成特色营养物质、表现菌种优良性状的必要条件。为了保证获得优良菌种而进行的母种培养条件的优化实验，有利于姬松茸母种的母种保存以及原种和后续生产的顺利进行。

正交试验设计是一种适用于对试验结果有影响的因素较多、考察试验结果的指标较多或者各因素之间互相有影响的比较复杂的试验。正交试验设计法就是用一套规格化的表（正交表）安排多个影响因素试验的方法，是一种简单方便、省时省力的科学方法，在农业科学研究中被广泛应用。史红鸽等[19]采用正交实验法优化了香菇母种培养基组成，结果发现细木屑、葡萄糖、琼脂粉、马铃薯是香菇母种培养基的较优组成。谢婷等[20]以香菇“森源16”为试验材料，以菌丝生物量、菌丝球密度和直径为评价指标项目，采用正交试验设计优化了香菇摇瓶液体发酵工艺。严燕兵等[13]采用正交试验设计得出金针菇菌丝体发酵的较优液体培养基组成。邓超等[14]采用正交试验优化了茶树菇深层发酵培养基的组成，促进了茶树菇多糖产量的提升。

本实验结果表明，24～30 ℃是姬松茸母种菌株生长的最适温度范围，菌丝生长速率较高，其中在27 ℃条件下菌丝的生长速度最高，达到4.6 mm‧d-1。随着培养基pH值的不断增加，姬松茸菌丝生长速度呈先增加，后降低的变化趋势。当培养基pH值为6时，菌丝的生长速度最高，达到4.5mm·d-1。在黑暗条件下，姬松茸菌丝生长速度较快。马铃薯培养基是适合姬松茸母种菌丝生长的较优培养基。正交试验结果表明，采用加富培养基在培养温度为27 ℃，pH值为6的条件下，菌丝生长速度最高；pH值是影响姬松茸母种菌丝生长的最关键因素，在母种培养时应着重加以注意。

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Culture Conditions ofMurrill by the Orthogonal Test

ZHANG Qin, CHENG Wen-jing*

201699,

Murrill has natural edible and medicinal value. It is a kind of natural probiotics, especially in medicine. It has a good preventive and therapeutic effect on cancer and tumor. In this study, theMurrill strain JS05 was used as material, in order to investigate effects of temperature, illumination intensity, pH value and culture medium on strain growth. The results showed that 24-30 ℃ were suitable toMurrill strain，and the optimal temperature was 27 ℃ with the strain growth rate of 4.6 mm·d-1. The strain growth rate was the highest under the treatment of culture medium pH = 6. The strain grew better in the dark compared to in the light. The JS05 strain grew better in the potato culture media than that in the corn powder culture medium. The results of orthogonal experiment showed that the JS05 strain grew better in enriched PDA culture medium, when the culture temperature was 27 ℃ and the pH value was 6, resulting the maximum strain growth rate. Among the three factors, the pH value was the most important factors related to the growth ofMurrill strain JS05.

Murrill; culture; condition optimum

S646

A

1000-2324(2022)01-0029-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.01.005

2021-06-05

2021-07-29

上海市“科技创新行动计划”农业领域项目(20392001300)

张琴(1983-),女,硕士,讲师,研究方向：蔬菜专业，植物生理生化方向. E-mail:zhangqin1260810@126.com

Author for correspondence. E-mail:chengwenjing1983@126.com