绿茶有效组分固定剂量联合对牙周炎大鼠的治疗效果*

莫汉佳， 李智炫， 黄斯铭， 吴子湘， 何勇， 薛子轩， 辛冰艳， 周冬华**

(1.长沙医学院 口腔医学院， 湖南 长沙 410219; 2.湖南师范大学医学院 预防医学系， 湖南 长沙 410205)

牙周炎是兼具感染性、自愈性、系统性特征的常见口腔疾病，与患者口腔不良卫生、饮食习惯以及外界刺激等因素有关，由于病情反复而长期困扰患者，其病程迁延会导致系列并发症的发生，重者出现牙龈严重萎缩、牙齿脱落[1-2]。我国居民饮茶历史悠久，茶中富含多种人体必需的微量元素，适量饮茶有祛热利便、杀菌解毒以及降脂促消等功效[3-4]。国内流调数据显示，适量饮茶有助于降低牙周炎发病率[5]，为进一步探查绿茶中主要组分对牙周炎疾病的治疗效果及联用差别，对288只牙周炎模型大鼠进行研究，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 实验对象及造模

2019年2月—2020年6月选取SD大鼠，2月龄，雌雄各半，体质量203～245 g、平均(220.13±12.01)g，由长沙医学院机能实验室动物实验中心提供，编号43006700019859；室内培养温度维持(26.0±2.0)℃，湿度维持(35.0±5.0)%，采取标准光照射。根据文献[6-7]方法，采用结扎丝压迫牙龈的方式建立大鼠牙周炎动物模型，具体方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉后固定于手术板，采用根管锉(15-30#K型)剥离大鼠第一磨牙和第二磨牙的牙龈，同时适当扩大两颗牙齿之间的牙间隙，而后采用双股丝线结扎两颗磨牙，并保持结扎线处于龈沟内，最后使用根管锉配合手术刀离断磨牙下方牙槽的神经。成功造模标准：全口牙平均附着丧失0.6～1.5 mm，邻面牙平均附着丧失<3 mm。成功造模288只牙周炎大鼠。本研究获得长沙医学院基础医学院医学伦理备案(备案号2020069)。

1.2 研究方法

1.2.1分组处理 采用随机数字表分为9组，研究全程未发生大鼠死亡，体质量、雌雄、月龄构成均衡(P>0.001)，药物配置方法见表1，8种药物分别加入8组大鼠日常饮用水(300 mL)中，连续干预5 d。

表1 9组大鼠饮用水配制方法Tab.1 Configuration of drinking water for rats of the 9 groups

1.2.2数据收集 干预前和干预后分两次采集大鼠的龈沟液和血液标本，每次取样前均使用乳化异氟烷(液态异氟烷1.2 mL+30%脂肪乳21.3 mL)腹腔注射麻醉。龈沟液标本：无菌洁治器械清除大鼠牙菌斑，使用气枪对相邻牙龈组织和牙颊面进行干燥，将无菌滤纸插入取样牙周袋内约1 mm，30 s后取出滤纸放入Eppendorf小管(无热源)中密封(若滤纸条带血则取样不合格)，冰冻(5 ℃以下)送检；脂联素(adipose tissue，ADP)用酶联免疫法检测、内毒素(endotoxin，RSE)用鲎实验法检测。血液标本：大鼠空腹状态下抽尾部静脉血，1 000 r/min离心15 min，获得上层血清，用PUZS 300A/X全自动生化检测仪(北京普朗新技术有限公司)检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-17(interleukin 17，IL-17)含量[8]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 干预前后龈沟液中ADP和RSE含量

相比干预前，干预后单用1组、单用2组、联用1组、联用2组、联用3组、联用4组ADP含量升高，而RSE含量降低，差异有统计学意义(P<0.001)；干预后ADP含量，单用1组和单用2组高于空白组、联用1组高于单用1组、联用2组高于单用2组、联用4组高于单用2组，差异有统计学意义(t=5.803、4.856、5.863、5.751、3.921，P<0.001)。干预后RSE含量，单用1组和单用2组低于空白组、联用1组低于单用1组、联用2组低于单用2组、联用4组高于单用2组，差异有统计学意义(t=7.781、3.835、17.434、15.839、9.407，P<0.001)。见表2。

表2 9组大鼠干预前后龈沟液中ADP和RSE含量比较Tab.2 Comparison of ADP and RSE contents in gingival crevicular fluid of rats before and after

2.2 干预前后血清TNF-α、IL-17含量

相比干预前，干预后单用1组、联用1组、联用2组、联用3组、联用4组TNF-α含量降低，单用1组、单用2组、单用3组、单用4组、联用1组、联用2组、联用3组、联用4组IL-17含量降低，差异均有统计学意义(P<0.001)。干预后TNF-α含量，单用1组低于空白组、联用2组低于单用2组、联用4组低于单用2组，差异有统计学意义(t=7.814，8.838、6.946，P<0.001)。干预后IL-17含量，单用1组、单用2组、单用3组、单用4组低于空白组，联用1组低于单用1组、联用2组低于单用2组、联用4组低于单用2组，组间差异均有统计学意义(t=8.917、4.624、8.213、5.150，5.288、13.710、8.289；P<0.001)。见表3。

2.3 绿茶4种组分两两联合使用时相加交互作用

绿茶4种组分两两联合使用，均存在相加交互作用，交互作用强度由强到弱依次为茶多酚联用锌(AP=70.27)、茶多酚联用铁(AP=21.66)、咖啡碱联用锌(AP=13.80)、咖啡碱联用铁(AP=12.21)。见表4。

表3 9组大鼠干预前后血清TNF-α、IL-17含量比较Tab.3 Comparison of serum TNF-α and IL-17 contents in the 9 groups before and after intervention

表4 绿茶4种组分两两联合使用时相加交互作用结果Tab.4 The effects of interaction of the four components in green tea

3 讨论

绿茶组分构成繁杂，不同组分有效含量差异巨大，现有研究可知，绿茶中的茶多酚、单宁酸均有抑制细菌、护牙釉质的功效。我国诸多地区尤其是南方丘陵地带具有悠久的种茶、饮茶、用茶习俗，古药方中也有将绿茶用于心血管疾病、炎性疾病治疗的记载[9-10]。随着物质组分分离和高纯提取技术不断进步，绿茶中的主要有效组分愈发明确，其中2种有机物(茶多酚、咖啡碱)和2种微量元素(锌、铁)的含量相对较高[11-12]。充分了解4种物质单独或联合应用对牙周炎大鼠产生的具体影响，将有助于科学宣教绿茶功效，并为其在口腔疾病上的药用提供一定理论支撑。

研究发现，干预后的单用1组、单用2组和4组联用组ADP含量升高，而RSE含量降低，说明茶多酚和咖啡碱对局部细菌的抑制作用尤为明显。牙菌斑中的革兰阴性菌是引发宿主产生严重免疫反应或炎性改变的重要诱因，其能持续排放RSE而侵袭牙周组织或牙槽骨质，甚至直接损害牙龈成纤维细胞的活力[13-14]。ADP则是由脂肪细胞少量分泌的，具有高度特异性的胰岛素增敏激素，其能持续影响促炎因子的刺激反应和抗炎效果，因此被当做人体的保护性细胞因子[15]。茶多酚抗菌效果实现主要与其能降低细菌葡萄糖基转移酶的生理活性、减少牙齿表面细菌黏附有关，部分口腔科应用的光谱杀菌剂适量添加了茶多酚组分，发现添加该物质后，杀菌剂能更好的调节口腔菌群，并减轻药剂的粘膜刺激性[16]。咖啡碱由黄嘌呤生物碱与茶黄素两种物质缔合而成，是茶汤饮入时产生苦感的风味物质。绿茶中咖啡碱含量保持在2.69%～3.11%[17]，既往研究认为该物质主要功效是缓解疲劳及神经兴奋[18]。本研究发现咖啡碱亦有一定的抗菌功效，其发挥效果的主要机制可能是通过调节巨噬细胞JMJD3-IRF4轴而促进抗菌功效得以实现的[19]，具体生理机制仍需探究。

研究还发现，绿茶中的茶多酚或锌元素单独使用时具有不同程度的抗炎功效。茶多酚是绿茶产品价值最大化的主要关键点及宣传点，实际上茶多酚是多酚类物质元素的集合体，黄烷醇类和酚酸类则是茶多酚中两种最主要功效成分[20]。茶多酚发挥抗炎作用主要与稠环芳香烃有效抑制了唾液中淀粉酶的活性，从而快速阻断淀粉食物糖的的供给途径有关[21]。此外，茶多酚亦可以影响细菌表面脂磷壁酸的产生和消除过程，从而在抑制细菌增殖层面来缓解炎症程度。锌元素发挥组织局部抗炎作用主要与影响糖皮质激素受体活性，进而抑制白细胞贴壁活化过程有关[22]。

重点分析联合组抗菌、抗炎效果的优势性。干预后比较发现ADP含量的变化为联用1组高于单用1组、联用2组高于单用2组、联用4组干预单用2组，而TNF-α含量变化为联用2组低于单用2组、联用4组低于单用2组；无论何种搭配，从整体来看茶多酚联用铁元素、锌元素均有益于抗菌效果的充分发挥，而咖啡碱联合锌元素对抗菌效果则有确切的加强作用。与不同物质发挥抗菌作用的途径存在显著差别有关，茶多酚联合锌元素能最大程度控制金属基质蛋白酶的活性，从而减少骨组织的被动吸收过程，组织修复加速也能增强抗菌作用[23]。而咖啡碱联合锌元素发挥作用的基础可能与锌元素有关，这两种物质联合应用产生交互作用的机制值得研究。

同时，联用2组或联用4组大鼠血清中TNF-α含量低于单用2组，而联用1组IL-17含量低于单用1组，联用2组IL-17含量低于单用2组，联用4组IL-17含量低于单用2组，该组数据说明茶多酚联用铁元素、锌元素能增强抗炎作用。该结果与表3进行的相加交互作用分析结果相一致，进一步比较发现，相加交互作用强度由高到低依次为茶多酚联用锌、茶多酚联用铁、咖啡碱联用锌、咖啡碱联用铁。因此在绿茶应用过程中，无论选择何种有效组分，均不能忽视茶多酚的基础、核心功效[24]，而适当添加辅料则可能有益于绿茶药效的进一步提升。

本研究由于经费有限，大鼠培养和研究时间相对较短，所以具有一定的局限性，仅能观察获得绿茶4种组分的短期应用效果。同时，为简化操作步骤，实验中应用的4种组分为标准品搭配而成，并非直接使用绿茶提取有效物质，所得结论具有一定偏倚的可能。