杵针对糖尿病周围神经病变Keap1/Nrf2/ARE通路及氧化应激的影响研究

王 芳，杨 慧，廖顺琪，王 瑶，王 寒，翁夕媚，黄亚玲

（1.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072；2.成都中医药大学，四川 成都 610075）

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是指糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者出现的周围神经损伤症状和/或体征，不包括其他原因所致的神经病变，其中至少50%的DM 患者发生DPN［1，2］。DPN 主要影响四肢远端对称感觉功能，是引起下肢溃疡、非创伤性截肢的重要原因。目前的研究发现氧化应激是DPN 的启动因素。在高血糖状态下，活性氧（reactive oxygen，ROS）和糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）显著增加，使得机体的抗氧化防御能力减弱，损伤组织细胞，破坏血管内皮功能，最终引起缺血性神经损伤［3］。其中Kelch 样ECH 相关蛋白1（Keap1）/核因子相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）是氧化应激关键通路，是否能通过调控该信号通路，达到抑制氧化应激的作用，从而保护和修复DPN 神经损伤成为研究热点。国家级非物质文化遗产李氏杵针是四川省名老中医李仲愚教授家传秘法。杵针疗法应用特殊针具和手法，通过刺激其特殊穴位和体表腧穴，作用于经络、脏腑，引导经气运行，促进经络气血的流通。团队前期研究发现杵针可改善DPN 患者的感觉神经功能及临床症状，并且患者依从性高［4，5］，但其作用机制尚不明确。本次研究从氧化应激的角度，揭示杵针治疗DPN 的机制，现将结果汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2021 年4～9 月从成都中医药大学医院内分泌科选择符合纳入标准的住院患者60 例，按1∶1 的分配比例随机到对照组和杵针组。由一名独立人员进行随机分组，使用计算机生成随机数（1 到60）。并规定抽到奇数号的受试者纳入杵针组，偶数号的受试者纳入对照组。然后，将随机数密封在不透明信封中，让患者提取密封的数字。杵针组30 例，男性17 例，女性13 例，年龄59～75 岁，平均（66.72±5.47）岁，糖尿病病程2～18 年，平均（9.79±4.45）年，DPN 病程1～9 年，平均（4.98±3.56）年；对照组30 例，男性16 例，女性14 例，年龄49～75 岁，平均（63.87±6.46）岁、糖尿病病程3～18 年，平均（10.75±3.67）年，DPN 病程2～9 年，平均（5.43±2.46）年。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。研究设计符合人体试验伦理标准，由成都中医药大学附属医院伦理委员会批准，伦理批件号：2021KL-107。所有患者在干预前签署知情同意书。

1.2 诊断标准

所有患者符合中华医会学糖尿病学分会《中国2 型糖尿病防治指南》（2020 年）对2 型糖尿病及DPN 的诊断依据［6］。

1.3 纳入标准

（1）患者符合上述诊断标准；（2）年龄18～75岁；（3）意识清醒，配合检查及治疗者；（4）自愿参加本研究并签署知情同意书者。

1.4 排除标准

（1）合并重要脏器严重疾病；（2）糖尿病急性并发症者；（3）取穴施杵部位皮肤受损者；（4）妊娠或哺乳期妇女。

1.5 病例剔除和中止

（1）未按研究方案进行常规治疗及杵针干预者；（2）不愿继续参加者；（3）病情恶化，或并发其他严重疾病的病例者。

1.6 治疗方法

1.6.1 对照组 对照组在常规降糖、降脂等治疗的基础上使用α-硫辛酸（规格：12 mL∶300 mg），给药方式静脉滴注，1 次/d。

1.6.2 杵针组 在对照组的基础上采用杵针治疗。

1.6.2.1 杵针针具 杵针疗法的器具：包括奎星笔、金刚杵、七曜混元杵、五星三台杵。见图1。

图1 杵针疗法器具Fig 1 Pestle and needle therapy apparatus

1.6.2.2 杵针选穴 根据《杵针学》［7］、《针灸学》［8］及相关的糖尿病及针灸专家咨询结果，确定杵针主穴为至阳八阵（至阳到膈关穴的距离所布的八阵）、命门八阵（命门到志室穴的距离所布的八阵）、河车命强段以（总7 条线，分别以中线左右旁开0.5 寸、1.5寸、3 寸画线）并配以足三里、三阴交、太溪、涌泉。见图2。

图2 杵针选穴示意图Fig 2 Schematic diagram of acupoints

1.6.2.3 杵针操作手法 施杵的方法按《杵针学》所述的操作规范。根据穴位的特点选择适宜的操作手法，每种操作手法均以7 次为一个循环。（1）患者俯卧于床上，至阳八阵穴用五星三台杵尖反复叩击，如雀啄食。以叩至皮肤潮红为度，约3～5 min；用七曜混元杵的针柄紧贴施术腧穴皮肤，作从中宫至外八阵的太极运转，重复操作，约3～5 min。（2）命门八阵穴的操作手法同1。（3）应用七曜混元杵针尖循行于河车命强段的7 条线上，作左右分推，上下推退的分理手法，约5 min。再使用五星三台杵尖反复叩击7 条线，约2 min。（4）取仰卧位，持金刚杵杵尖贯力达于足三里，向下行杵，随后缓慢上提，但针尖不能离开皮肤，行开阖手法。约2～3 min；再持奎星笔行点叩手法，约2～3 min；最后持五星三台杵针柄行运转手法约2～3 min。（5）三阴交、太溪、涌泉杵针治疗手法同足三里。杵针治疗每日一次每次约30 min，5 次一个疗程，期间休息2 d，共治疗4 个疗程。

1.7 观察指标

检测氧化应激相关指标：比色法检测血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的含量；ELISA 法测定血清Keap1/Nrf2/ARE 信号通路相关因子表达水平；RT-PCR 检测Keap1、Nrf2mRNA 表达。分别于治疗前后各采血5 mL，送至本院中心实验室进行检测。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 两组治疗前后血清SOD、GSH-px 含量比较

与治疗前相比，治疗后对照组和杵针组SOD 含量显著升高（t=-2.467，P=0.043；t=-3.642，P=0.008），血清GSH-px 含量也显著升高（t=-4.163，P=0.004；t=-7.728，P＜0.001）；治疗后，与对照组相比，杵针组SOD、GSH-px 含量明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 两组治疗前后SOD 和GSH-px 含量比较（U/mL，n=30，±s）Tab 1 SOD and GSH-px levels before and after treatment in the two groups（U/mL，n=30，±s）

表1 两组治疗前后SOD 和GSH-px 含量比较（U/mL，n=30，±s）Tab 1 SOD and GSH-px levels before and after treatment in the two groups（U/mL，n=30，±s）

注：与治疗前比较，*P＜0.05。

组别对照组杵针组SOD治疗前73.56±7.94 67.77±20.01-0.761 0.466治疗后76.21±6.17*85.40±8.94*2.392 0.031 tP GSH-px治疗前230.46±40.08 248.41±45.47 0.838 0.416治疗后240.51±36.27*282.23±38.74*2.223 0.043

2.2 两组治疗前后血清Keap1、Nrf2 因子含量比较

与治疗前相比，治疗后对照组Keap1、Nrf2 含量无明显改变（t=1.946，P=0.093；t=-2.072，P=0.077），杵针组Keap1 表达量显著降低（t=8.039，P＜0.001），Nrf2 含量明显升高（t=-7.874，P＜0.001）。治疗后，杵针组Keap1 含量明显低于对照组，Nrf2 含量明显高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 两组治疗前后Keap1和Nrf2含量比较（pg/mL，n=30，±s）Tab 2 Keap1 and Nrf2 levels before and after treatment in the two group（pg/mL，n=30，±s）

表2 两组治疗前后Keap1和Nrf2含量比较（pg/mL，n=30，±s）Tab 2 Keap1 and Nrf2 levels before and after treatment in the two group（pg/mL，n=30，±s）

注：与治疗前比较，*P＜0.05。

组别Keap1治疗前430.93±34.85 Nrf2治疗前284.85±43.80治疗后423.93±37.87对照组治疗后294.90±39.61杵针组339.08±74.79*349.51±46.93*tP 393.13±77.71-1.255 0.230 2.515 0.025-2.915 0.011 281.00±66.12-0.137 0.893

2.3 两组治疗前后血清Keap1、Nrf2 mRNA 表达量比较

与治疗前相比，治疗后对照组Keap1、Nrf2mRNA 表达量无明显改变（t=0.989，P=0.356；t=-0.674，P=0.0.50），杵针组Keap1mRNA 表达量显著降低（t=-2.629，P=0.002），Nrf2mRNA表达量明显升高（t=4.640，P=0.047）；治疗后，杵针组Keap1mRNA 表达量明显低于对照组，Nrf2mRNA 表达量明显高于于对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 两组治疗前后Keap1 mRNA 和Nrf2 mRNA 含量比较（n=30，±s）Tab 3 Keap1 mRNA and Nrf2 mRNA levels before and after treatment in the two groups（n=30，±s）

表3 两组治疗前后Keap1 mRNA 和Nrf2 mRNA 含量比较（n=30，±s）Tab 3 Keap1 mRNA and Nrf2 mRNA levels before and after treatment in the two groups（n=30，±s）

注：与治疗前比较，*P＜0.05。

组别tP对照组杵针组Keap1 mRNA治疗前31.33±2.52 31.51±2.86 0.131 0.897治疗后33.59±1.86 37.14±1.91*3.104 0.013治疗后31.16±2.50 28.48±1.98*-2.373 0.033 Nrf2 mRNA治疗前33.48±1.57 35.10±1.71 1.617 0.140

3 讨论

DPN 的特点是周围神经纤维弥漫性损伤，导致麻木、疼痛和感觉丧失。中医独特的外治法通过多靶点及整体观的治疗方案在DPN 治疗中取得良好效果［9-11］。杵针作用于体表肌肉分层的经络气血，使邪气祛而不伤及肌肉筋膜之正气，兼针刺按摩之长，主治DPN 一类以筋肉痹痛为主要症状的疾病。本研究选以至阳八阵穴、命门八阵、河车命强段为基础方，应用特殊行杵手法（点叩、升降、分理、开阖）激发经气，引导经气运行，促进经络气血的流通，以达到补气血，平阴阳，补脾益肾，活血通络的作用。团队前期研究发现［12，13］，杵针疗法可以降低双足腓浅神经及足踝中部前方L4/L5/S1 区段细有髓鞘（Aδ）和无髓鞘（C）感觉神经纤维的快速电流感觉阈值及患者双足第一足趾趾腹和足背的震动感觉阈值，但其作用机制尚未阐明。

氧化应激是由高血糖引起的，被认为是DPN发病机制的启动因素［14-16］。高血糖通过葡萄糖的自氧化产生氧化应激，使致ROS 和活性氮物质的产生增加，氧化物质超过了抗氧化能力，使得机体的抗氧化防御能力下降［17］。ROS 通过氧化应激损伤神经细胞中的核酸、蛋白质、脂质等其他大分子，从而导致神经细胞损伤［15］。SOD、GSH-px 和谷胱甘肽（GSH）等是保护细胞免受ROS 伤害的主要抗氧化酶之一［18］。以往的研究表明，外周血细胞和高糖处理的RSC96 细胞中，抗氧化酶（GSH、SOD、GSH-Px）含量降低，而丙二醛（MDA）和ROS 积累［17］。然而，本研究结果表明，杵针可以使抗氧化酶含量升高，从而拮抗氧化应激。本研究结果显示杵针有效提高了DPN 患者血清SOD 和GSH-px 水平。表明杵针治疗DPN 可能是通过使血清中抗氧化物含量升高，维持DPN 患者ROS 平衡，从而达到抗氧化应激作用。

核因子相关因子2（Nrf2）及其基因靶点是内源性抗氧化系统的关键组成部分［19，20］。在机体正常生理状态下，Nrf2 在细胞质中处于与Keap1 结合的稳定状态。当细胞暴露在氧化剂和毒物中时，Nrf2 从Keap1 中释放出来，转移到细胞核内，并与抗氧化反应元件（ARE）结合，以诱导下游抗氧化酶的基因转录如SOD、GSH-px，从而保护细胞免受ROS 导致的损伤［21，22］。研究发现，促进Nrf2 的表达被证明对链脲佐菌素诱导的DM 和DPN 具有保护作用［23］。本研究结果显示，杵针可增加DPN 患者血清中Nrf2的水平。此外，杵针可阻断DPN 患者血清Keap1 的高水平表达。从基因的角度，我们深入研究了Nrf2和Keap1 的mRNA 表达。杵针显著增加了DPN 患者血清中Nrf2mRNA 的表达，并降低了Keap1mRNA 的表达，表明了杵针对Keap1-Nrf2/ARE 通路具有调控作用。

综上所述，本研究的结果表明了杵针对DPN 患者氧化损伤的保护作用与Keap1-Nrf2/ARE 通路的激活有关。本研究提供了临床实验证据，下一步可进行动物实验，从分子水平和形态学等方面进一步探索杵针治疗DPN 的作用机制。

作者贡献度说明：

王芳、杨慧：课题的设计，临床试验指导；王芳、廖顺琪：文章撰写；王寒、王瑶：资料收集、统计分析；翁夕媚、黄亚玲：患者治疗工作；王芳：数据审核。

所有作者无利益冲突。