鹌鹑MITF 基因的克隆、表达及启动子甲基化研究*

祁艳霞，张小辉 ，庞有志，刘 佩，任世威，霍琳珂

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003；2.洛阳市动物遗传育种重点实验室，河南 洛阳 471003)

羽色是鹌鹑重要的品种特征之一，也是其重要的经济性状。利用羽色进行自别雌雄不仅简单易行，而且准确率高，在蛋用鹌鹑生产中得到广泛应用[1]。朝鲜鹌鹑是中国蛋用鹌鹑生产的主要品种，常见的羽色有栗羽(野生型)、黄羽、白羽和黑羽等，其中栗羽和白羽可以通过羽色自别雌雄[2]，在鹌鹑蛋生产中占有一定比重。

MITF(microphthalmia-associtated transcription factor)基因与动物毛色形成之间的关系最初发现于小鼠，该基因突变导致小鼠毛色变浅、虹膜色素退减、小眼畸形和耳聋[3]，故将其命名为小眼畸形相关转录因子。MITF 蛋白由419个氨基酸残基组成，包含1个由90个氨基酸残基组成的基本—螺旋—环—螺旋—亮氨酸拉链(basic-helix-loophelix-leucine-zipper，bHLHLZip)结构[4]，是蛋白的转录激活功能域；在其N 末端和C 末端分别具有1个强转录激活结构功能区和1个富含丝氨酸的激活域[5]。

MITF基因在禽类羽色形成中同样发挥着重要作用，该基因突变或表达异常能导致羽色发生明显改变。在日本鹌鹑上，该基因第11 外显子发生2 bp 的缺失突变，导致编码蛋白的翻译提前终止，生成无生物活性的MITF 蛋白，可能是导致日本鹌鹑白羽突变的原因，同时，该突变对日本白羽鹌鹑的生长发育和生产性能产生一定的影响[6]。此外，MITF基因突变与浙东白鹅[7]和北京鸭[8-9]等水禽的白羽性状有关。本研究以MITF为候选基因，分析该基因在朝鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑羽色形成过程中的表达变化，克隆该基因的启动子区域，检测不同羽色鹌鹑MITF基因启动子的甲基化状态，从分子水平上研究MITF基因与鹌鹑羽色形成之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

试验用朝鲜鹌鹑(野生型)和北京白羽鹌鹑种蛋各60 枚，购于河南科技大学鹌鹑种业有限公司。

1.1.2 主要试剂

总RNA 提取试剂盒、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit、SYBR®Premix ExTaqTMII试剂盒、LATaq®with GC Buffer、DNA Ligation Kit、pMD-19T 载体和DH5α 大肠杆菌感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司；EpiTect Bisulfite Kit 购自Qiagen 公司；动物组织基因组DNA 提取试剂盒和DNA 纯化回收试剂盒购自TIANGEN 公司；琼脂糖、50×TAE、GoldView、DNA Marker 和2×RNA Loading Buffer 均购自北京Solarbio 科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

实时荧光定量PCR 仪、梯度PCR 仪和凝胶成像系统购自Bio-Rad 公司；超微量核酸浓度测定仪购自Thermo 公司；低温高速离心机购自湖南湘仪仪器开发有限公司；电泳仪和电泳槽购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种蛋孵化和组织样品采集

种蛋在恒温恒湿孵化器中孵化，孵化温度在第1～6 天为38 ℃，第7～14 天为37.8 ℃；孵化湿度为55%～65%。分别在孵化第6、8、10、12 和14天各取出10 枚种蛋，采集胚胎翅组织于液氮中保存，用于检测MITF基因mRNA 表达水平；在孵化第12 天另取出10 枚种蛋，采集翅组织用于MITF基因启动子区域克隆及甲基化分析。

1.2.2 总RNA 的提取及反转录

取适量鹌鹑翅组织于加入液氮的研钵中研成粉末状，用总RNA 提取试剂盒提取各组织样品的总RNA；将其溶解于DEPC 处理的双蒸水中，利用NanoDrop 2000 测定总RNA 的纯度和质量浓度；用DEPC 处理的双蒸水稀释至1 μg/μL，用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 的完整性；选择高质量的RNA 用PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA 第1 链。所有操作均参照试剂盒说明进行。

1.2.3 鹌鹑MITF基因CDS 区的克隆及生物信息学分析

参考日本鹌鹑MITF基因mRNA 序列(XM_015875345.2)设计引物M1 (表1)，以合成的cDNA第1 链为模板进行RT-PCR 扩增，总反应体系为20 μL，包括5 U/μL LATaq0.2 μL、2×GC Buffer I 10 μL、dNTP Mixture 3 μL、上下游引物各0.7 μL和cDNA 第1 链 1 μL，加水补至20 μL。PCR 扩增在C1000 梯度PCR 仪上进行，反应条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，36个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后送北京擎科新业有限公司测序。测序结果与GenBank 数据库进行BLAST 比对，用ORF Finder分析潜在的开放阅读框，利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白的分子量和等电点，利用在线软件SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析编码蛋白的信号肽，利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHM M/)分析蛋白的跨膜区信息，利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)预测蛋白的亚细胞定位。

1.2.4 鹌鹑MITF基因的RT-qPCR 分析

利用测序得到的鹌鹑MITF基因mRNA 序列设计引物M2 (表1)，分别以各组织样品的cDNA为模板进行RT-qPCR 分析。总反应体系为20 μL，包括2×SYBR Green Mix 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 模板1 μL 和ddH2O 7.4 μL。qPCR扩增在CFX96 Touch 荧光定量PCR 仪上进行，反应条件为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，57 ℃退火20 s，72℃延伸15 s，40个循环；添加熔解曲线分析，温度范围为65～95 ℃，每升高0.5 ℃测定1 次荧光值。每个样品设置3个重复，并在每次试验时设阴性对照。以鹌鹑GAP-DH基因为内参，用 2-ΔΔCt法计算MITF基因在各组织中的相对表达水平。

1.2.5 鹌鹑MITF基因启动子区域的克隆及序列分析

用动物组织基因组DNA 提取试剂盒提取各样品的基因组DNA，用NanoDrop 2000 测定其质量浓度和纯度，通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 质量，高质量的基因组DNA保存于-80 ℃冰箱备用。下载日本鹌鹑MITF基因第1 外显子及其之前的2 000 bp 基因组(NC_02 9527.1)序列，用Primer Premier 5.0 软件设计1 对克隆MITF基因启动子区域的引物M3 (表1)。以提取的基因组DNA 为模板，通过PCR 扩增鹌鹑MITF基因的启动子区域，总反应体系为20 μL，包括5 U/μL LATaq0.2 μL、2×GC Buffer I 10 μL、dNTP Mixture 3 μL、上下游引物各1 μL 和基因组DNA 1 μL，加水补至20 μL。PCR 扩增在C1000梯度PCR 仪上进行，反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，36个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后送北京擎科新业有限公司测序。利用NNPP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测核心启动子元件，利用PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)预测转录因子结合位点，利用CpGplot (https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)分析潜在的CpG 岛位置。

表1 引物信息表Tab.1 The information of primers

1.2.6 利用BS-PCR 技术检测MITF基因启动子区域的甲基化水平

取20 μL基因组DNA溶液于0.2 mL 的EP管中，参照EpiTect Bisulfite Kit 说明书进行重亚硫酸盐处理和回收。利用MethPrimer 在线软件针对预测的CpG 岛设计1 对特异性引物M4 (表1)。PCR 的反应体系为25 μL，包括PremixTaqTM12.5 μL、上下游引物各1 μL 和重亚硫酸盐处理后的基因组DNA 2 μL，加水补至25 μL。PCR 扩增在C1000 梯度PCR 仪上进行，反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后与pMD-19T 载体连接，转化到DH5α 大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含AMP 的固体LB 培养基上培养，随机挑选阳性克隆送北京擎科新业有限公司测序。

1.2.7 数据统计与分析

利用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，用2个样本t检验分析MITF基因在不同羽色鹌鹑组织间的表达差异；BS-PCR 测序结果用BiQ-Analyzer 软件分析CpG 位点的甲基化状态，然后用在线软件MSR calculate (www.msrcall.com/MSRcalcalate.aspx)绘制甲基化位点棒棒糖模型，计算每个样品甲基化百分比，用配对样本t检验法比较不同鹌鹑品种间MITF基因启动子区域的甲基化水平差异。

2 结果与分析

2.1 鹌鹑MITF 基因克隆及生物信息学分析

利用引物M1 克隆鹌鹑MITF基因的CDS区，PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测出现单一目标条带(图1)。产物经纯化回收后进行DNA 测序，经BLAST 比对分析后发现该序列与日本鹌鹑同源基因相似度达99%，与原鸡的相似度也达98%。开放阅读框分析表明：该序列包含1个1 476 bp 的完整开放阅读框，编码492个氨基酸残基。鹌鹑MITF 蛋白分子量54.8 ku，等电点6.07，该蛋白没有信号肽和明显的跨膜区，亚细胞定位发现成熟蛋白位于细胞核中。

图1 朝鲜鹌鹑MITF 基因CDS 区PCR 产物的电泳检测Fig.1 Electrophorogram of PCR product of MITF CDS in Korean quail

2.2 MITF 基因mRNA 在鹌鹑胚胎中的表达

由图2 可知：MITF基因的表达水平在鹌鹑胚胎发育的第6～10 天处于上升阶段，之后表达水平下降。鹌鹑胚胎发育的第6～12 天，MITF基因在朝鲜鹌鹑中的表达水平显著或极显著高于在北京白羽鹌鹑中的表达水平(P＜0.05 或P＜0.01)。

图2 MITF 基因mRNA 在鹌鹑胚胎发育不同阶段的相对表达水平Fig.2 Relative expression of MITF gene in different developmental stages of quail embryos

2.3 鹌鹑MITF 基因启动子区域的克隆及生物信息学分析

引物M3 的PCR 产物经纯化回收后进行DNA测序，得到1 267 bp 的启动子序列，该序列与日本鹌鹑基因组(NC_029527.1)上MITF基因启动子区域的同源性达99%。用NNPP 软件预测到该段序列包含1个核心启动子元件。用PROMO 软件发现该段序列含有丰富的转录因子结合位点，其中包括1个RNA 聚合酶结合位点 TATA-box (图3)。该段序列的平均GC 含量为65%，用MethPrimer 软件预测到该段序列包含1个346 bp的CpG 岛，预测到的核心启动子元件和TATA-box 均位于该CpG 岛上，因此，该CpG 岛可用于甲基化分析。

图3 MITF 基因启动子区域的顺式作用元件分析Fig.3 Cis-elements prediction of the MITF promoter sequence

2.4 鹌鹑MITF 基因启动子的甲基化分析

BS-PCR 产物测序后经BiQ-Analyzer 软件分析发现：在该CpG 岛上有9个CpG 位点(图4)，其中朝鲜鹌鹑的甲基化水平为18.52%，北京白羽鹌鹑的甲基化水平为29.63%，统计学分析表明两者甲基化水平差异显著(t=2.82，P=0.022＜0.05)。

图4 MITF 基因启动子甲基化结果Fig.4 Methylation results of MITF promoter

3 讨论

3.1 MITF 基因表达与禽类羽色形成的关系

MITF基因的表达能够促进黑素母细胞增殖分化，促进黑色素合成[10]，该基因突变导致动物皮肤和毛发色素沉积减少，故MITF基因被认定为影响动物毛色和羽色的关键候选基因[11]。LI 等[8]利用RNA-Seq 技术分析不同羽色鸭子毛囊组织的差异表达基因，发现MITF基因在黑羽毛囊组织中的表达水平极显著高于在白羽毛囊组织的表达水平。本研究中，朝鲜鹌鹑MITF基因的表达水平显著或极显著高于北京白羽鹌鹑，这与前人研究结果一致。MITF基因在黑色素细胞中特异性表达[12]，MITF 蛋白能够识别并结合TYR基因家族启动子区域的E-box，激活该基因家族中TYR和DCT等基因表达，从而合成黑色素[13]，故推测朝鲜鹌鹑较深的羽色与其MITF基因高表达有一定关系。鹌鹑胚胎发育的6～8 d 是绒毛大量形成的时期，也是黑色素沉积旺盛的时期[14]，本研究发现MITF基因在胚胎发育的6～10 d 处于上升阶段，可能与该时期黑色素大量合成有关。成熟的miRNA 能够与靶基因mRNA 通过碱基互补配对的方式结合，降低靶基因的表达水平。目前已鉴定出多个靶向MITF基因的miRNA[15]，其中miR-101a-3p和miR-144a-3p能够与羊驼MITF基因的3′ UTR 结合，抑制MITF基因表达，减少黑色素形成[16]；miR-186-5p也能在绵羊黑色素细胞中达到同样效果[17]。miR-137的靶基因也是MITF，将miR-137注射到黑皮肤小鼠胚胎中，出生后的小鼠肤色变浅，其皮肤组织中MITF基因mRNA 的表达水平显著低于正常小鼠[18]。这些研究表明：下调MITF基因的表达水平导致黑色素合成减少，这与本研究中北京白羽鹌鹑MITF基因的表达水平极显著或显著低于朝鲜鹌鹑的结果一致，说明MITF基因对动物皮肤和毛发中色素沉积起重要的调控作用。

3.2 启动子甲基化与基因表达的关系

基因启动子区CpG 岛的甲基化和去甲基化是基因表达调控的重要方式。通常情况下，启动子区域CG 碱基甲基化水平升高可抑制基因表达，而甲基化水平降低能够激活基因表达[19]。白羽莆田鸭皮肤毛囊组织中MITF基因启动子区域的甲基化水平显著高于黑羽莆田鸭，且启动子CpG 岛的甲基化水平越高，MITF基因的表达水平越低，两者呈显著负相关[20]。类似现象在獭兔[21]、斑点狗[22]和鲫鱼[23]都有发现。本研究中，朝鲜鹌鹑MITF基因的表达水平显著高于北京白羽鹌鹑，可能与朝鲜鹌鹑MITF基因启动子区域低甲基化有关。MITF基因启动子甲基化状态与表达水平间的关系在人类黑色素瘤细胞系中得到了深入研究[24-25]。黑素细胞癌变后MITF基因表达水平下降，其启动子区域的甲基化水平升高[26]，特别是TSS (transcription start site) 附近的CG 碱基甲基化对基因的表达水平有显著影响[27]。北极狐MITF基因启动子区存在1个524 bp 的高活性区(-510 bp/+13 bp)，该区域的突变对MITF基因表达有显著影响[28]。本研究在朝鲜鹌鹑MITF基因启动子区域发现1个346 bp 的CpG 岛和多个核心启动子元件，位置与北极狐MITF基因启动子的高活性区域重合，都紧邻TSS 上游，说明该CpG 岛上CG 碱基的甲基化和去甲基化对MITF基因的表达水平影响较大。

4 结论

北京白羽鹌鹑MITF基因表达水平显著低于朝鲜鹌鹑，这是导致羽色白化的原因之一。鹌鹑MITF基因启动子区存在1个CpG 岛和多个核心启动子元件，该基因的表达受CpG 岛甲基化调控，高甲基化抑制MITF基因表达。