逆灸对亚健康状态大鼠下丘脑内质网应激通路中PERK、ATF4的影响*

杜旭 张容超 刘娟 张豪斌 李玉杰 胡文静

(陕西中医药大学 针灸推拿学院,陕西 咸阳 712046)

目前在人类生理、心理承受的压力越来越大的趋势下，神经-内分泌-免疫网络长期处于应激状态，导致亚健康状态人群越来越多。2016年WHO报告，全球范围内亚健康状态人数超过60亿人，占全球总人口的85%[1]；而中国总体已约占17.8%～60.5%[2]。祖国医学认为亚健康状态属“治未病”范畴。灸法作为中医的特色疗法，在本领域已初步显示出其优势和潜在能量，具有巨大发展空间[3]。灸法能明显改善亚健康患者的疲劳症状和生活质量，提高机体免疫能力；在缓解紧张、抑郁、焦虑等方面效果明显；无副作用；简便，易操作，安全性高[4-8]。而“逆灸”是特殊灸法，属“逆针灸”，源于《内经》“治未病”思想，即在机体的健康状态、发病前或疾病轻浅时，预先施以灸法，来激发机体经气、抗病与应变能力，从而维护健康、防病减损。“逆灸”干预亚健康状态可显著改善患者中医症候积分、中医症候、睡眠情况、疲劳症状和生存质量，显著降低患者经络能量指数、精神状态指数、筋骨气血指数、新陈代谢指数、自律神经指数的异常率[9]，但其机制研究鲜见。因此本研究拟从神经-内分泌-免疫网络的调节枢纽——下丘脑的内质网应激通路探究其部分机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠30只(西安交通大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK2020-003)，♂，体质量(250±30)g，以随机数字表法分为空白组(10只)、模型组(10只)和逆灸组(10只)，实验全程按2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》规定的啮齿类实验动物常规饲养。

1.2主要仪器与试剂 奥林巴斯BX51型显微镜、徕卡APERI0 VERSA 8扫描仪等。PERK抗体(北京博奥森，批号：bs-2469R)；ATF4抗体(武汉博士德，批号：A00371-1)、即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒(武汉博士德，批号：SA1022)。艾条(南阳市卧龙汉医艾绒厂，规格:18 mm×200 mm)。

1.3模型制备 参照文献[10]，共两部分，次序采用数字随机表安排。以旷场实验等行为学评价统计学有差异为成功标志。

1.3.1自制大鼠活动限制筒 取长15 cm，内径5.5 cm透明的坚固塑料圆筒，筒壁设有若干直径约0.2 cm的圆孔，一端封闭，另一端设有可移动的塑料厚片塞，并通过连接在其上的长柄来控制大鼠移动空间。每日9时至12时将大鼠置于筒内，根据其身长，调节移动塞的位置，使大鼠不能自由活动，但保证无损伤，不影响其呼吸和排泄。每日1次，每次3 h，同时禁止饮食。连续造模21 d。

1.3.2自制160 cm×80 cm×65 cm注水鼠箱 水温25 ℃左右，水深30 cm。每天16时将大鼠置入水箱中。第1周强迫游泳20 min，第2、3周时间分别为30 min、40 min。连续造模21 d。

1.4干预方法 空白组：不做治疗，每日1次模拟抓拿固定。

模型组：第1 d开始不做治疗，每日1次模拟抓拿固定，至第24 d开始采用束缚应激结合游泳运动制备模型，每日1次，共21次。

逆灸组：第1 d开始逆灸，7 d一个疗程，持续3个疗程共21 d，疗程间隔1 d。参考余曙光主编2016版《实验针灸学》中常用动物穴位定位法，取大鼠百会、足三里和肾俞穴。将大鼠固定于自制鼠板上，腧穴处剪毛，将艾条固定于自制艾灸支架上，垂直距离大鼠穴位约3 cm施灸，每日1次，每次20 min。至第24 d开始造模，每日1次，共21次。

1.5指标检测

1.5.1旷场实验 实验第23 d、45 d进行，观察大鼠在新异环境中的自主行为、探究行为和紧张度。场箱规格：50 cm×50 cm×50 cm，四周、底面均涂以黑色，底面用白色线条标记为5×5的方格。实验时，将大鼠置于场箱中央格，观察其5 min内，方格间穿行(水平运动)次数，以大鼠三爪以上跨入邻格的次数为1次；竖起(垂直运动)次数，以大鼠双前肢离地以上的次数为1次。

1.5.2PERK、ATF4免疫组化检测 第45 d将各组大鼠断头处死，冰上迅速剖取脑，取下丘脑组织常规制作石蜡切片。常规脱腊水化；加内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min后清洗，将切片放入EDTA抗原修复液中加热8 min后冷却至室温；滴加5%BSA封闭液室温封闭30 min，倾去多余液体；加入ATF4(1∶100)、PERK(1∶200)抗体4 ℃孵育过夜，复温后用PBS洗涤3次，每次5 min；滴加羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次，5 min/次；滴加SABC孵育30 min，PBS洗5 min×4次；加入DAB显色液显色，观察后水洗；滴加Mayor苏木素室温孵育1 min，清洗；树胶封片、镜检；使用Image-ProPlus采集图片积分光密度(integrated option density，IOD)。

2 结果

2.1各组大鼠旷场实验结果比较 见表1。

表1 各组大鼠旷场实验结果比较

表1示，第23 d后，逆灸组大鼠水平和垂直运动较模型组均有非常明显差异(P<0.01)。第45 d后，模型组大鼠水平和垂直运动明显减弱，与空白组有非常明显差异(P<0.01)；逆灸组大鼠水平和垂直运动能力较空白组低、较模型组高，均有非常明显差异(P<0.01)。

2.2各组大鼠PERK、ATF4表达比较 见表2。

表2 各组大鼠PERK、ATF4表达比较

表2示，第45 d后，与空白组比较，模型组、逆灸组大鼠PERK含量明显升高，模型组有非常明显差异(P<0.01)，逆灸组有明显差异(P<0.05)；与模型组比较，逆灸组较低，有明显差异(P<0.05)。与空白组比较，模型组、逆灸组大鼠ATF4含量也明显升高，均有明显差异(P<0.05)，与模型组比较，逆灸组也较低，有明显差异(P<0.05)。

3 讨论

亚健康状态在祖国医学中属于“虚劳”范畴，主要以补肾健脾、益气养血为治疗原则。对相关3篇文献(4个研究，591例受试者)进行系统评价发现，针灸在改善亚健康人群总体症状和睡眠指数等单个症状方面可能优于阳性对照[11]。数据挖掘研究表明，现代针灸治疗亚健康频次最高的5个腧穴为足三里、三阴交、百会、肾俞及关元[12]。足三里穴为足阳明胃经的合穴、下合穴，可健脾益胃、益气补血、扶正培元，为保健要穴；多灸足三里，可培补正气，补益脏腑。肾俞是肾之精气在腰部深聚部位，可填精益气。百会为三阳五会，可调补阳气，醒脑开窍。已有机理研究表明，灸法可以明显改善亚健康患者的免疫状态、生活质量及甲襞微循环等，且无副作用，安全性高，是一种理想、简捷、有效的疗法[13-14]。但相关研究仍较缺乏，最具特色的“逆灸”预防亚健康状态机理研究更是鲜见。

现代医学认为，亚健康状态是长期应激导致的神经-内分泌-免疫网络失调，而下丘脑HPA轴是神经-内分泌-免疫网络枢纽，对机体应激反应过程起着核心作用[15]。我们前期研究聚焦于HPA轴，发现逆灸预防亚健康状态可能是通过调控HPA轴-5-HT通路进而调节神经-内分泌-免疫网络来发挥作用的；逆灸可能是预防机体长期慢性应激损害的有效手段，能够启动机体内源性保护机制，调动自我反馈、调节机制以维持内环境稳定[16]。下丘脑神经细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可能是应激过程中的关键因素和潜在的研究热点。内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞中最大的细胞器，在细胞中具有重要作用。ER合成、转运、整合、翻译、修饰蛋白质，合成磷脂和胆固醇，调节细胞内稳态的作用重大。ERS是ER功能稳态失衡时，引起ER腔内未折叠、错误折叠蛋白增加或Ca2+平衡紊乱的状态，ERS早期或未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)能提高细胞在有害因素下的生存能力，减轻累积的蛋白质对细胞造成损害，是真核细胞的一种保护性应激反应，但剧烈或者持久的ERS能诱导细胞凋亡或死亡[17]。ERS诱导细胞凋亡与维持细胞内环境稳定的重要进化保守机制——自噬密切相关，存在共同的上游信号通路，包括蛋白激酶RNA样内质网激酶(PKR-like ER kinase，PERK)/诱导激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、Ca2+等[18]。PERK是唯一存在于ER内的丝氨酸或苏氨酸激酶，在ER腔内具有应激感应域，与应激密切相关[19]。ATF4则可上调编码C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表达，影响其靶基因转录，调控细胞损伤修复机制，如生长停滞及DNA损伤诱导蛋白34(growth arrest and DNA damage-inducible protein 34，GADD34)等的表达[20]。研究表明，中药单体、中成药、复方及针灸，都可有效影响细胞内质网应激以及细胞凋亡因子的表达[21-23]。本研究结果显示，与模型组比较，逆灸可提高大鼠旷场实验活动能力，效应肯定；同时也能降低PERK、ATF4表达。一定程度上表明，逆灸预防亚健康状态可能与下丘脑神经细胞内质网应激通路中PERK、ATF4相关，可能是揭示逆灸预防亚健康状态的一个途径。