依托咪酯对脊髓损伤大鼠的脑保护作用及其机制研究*

杨光，姚富，陈永旺，刘玉林

（1.西南医科大学，四川泸州646000；2.四川省骨科医院，四川成都610041；3.西南医科大学附属医院麻醉科，四川泸州646000）

Abstarct: Objective To investigate the cerebral protective effect of etomidate in rats with spinal cord injury(SCI), and to analyze the underlying mechanism. Methods Fifty of the 62 SPF male SD rats were used to establish the SCI models, and the successfully-established rat models (n = 48) were randomly divided into model group (n =12),low-dose etomidate group(n=12),medium-dose etomidate group(n=12)and high-dose etomidate group(n=12). The rest 12 rats were set as sham-operation group where only the T9 to T11 vertebral plates were removed without injuring the spinal cord. The low-, medium- and high-dose etomidate groups were injected 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg,and 2.7 mg/kg of etomidate fat emulsion injection,respectively through the tail veins once a day for 4 weeks.The rats in sham-operation group and model group were injected with the same amount of normal saline via tail veins at the same time.The neurobehavioral scores were evaluated after 4 weeks,and the levels of interleukin-1(IL-1β) and IL-18 in the cerebral spinal fluid (CSF) were measured via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to observe the histopathological changes of the spinal cord in each group. The mRNA levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues of rats were detected by quantitative realtime polymerase chain reaction(qRT-PCR).The protein levels of NLRP3 and Caspase-1 were measured by Western blotting. Results Compared with the sham-operation group,the BBB scores were decreased,the levels of IL-1β and IL-18 in CSF were higher, and the mRNA and protein levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues were increased in the model group, and low-, medium- and high-dose etomidate groups (P ＜0.05). However, the BBB scores were higher,and the levels of IL-1β and IL-18 in CSF as well as the mRNA and protein levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues were lower in the low-, medium- and high-dose etomidate groups than those in the model group(P ＜0.05). Conclusions Etomidate plays a cerebral protective role in SCI,potentially by inhibiting the activation of NLRP3/Caspase-1 pathway and attenuating the inflammatory response.

脊髓损伤（spinal cord injury， SCI）是常见的中枢神经系统疾病，是各种原因导致椎管内神经结构及其功能损害而引起的脊髓功能障碍，会导致神经系统严重并发症，严重影响患者的生活质量[1]。随着我国交通和建筑业的发展，SCI 发病率呈逐年上升趋势，其病理生理机制复杂，临床治疗效果非常有限。有研究表明，炎症反应与SCI 进展关系密切[2]。依托咪酯是一种短效非巴比妥类静脉全身麻醉药物，具有起效快、镇静作用完全、对呼吸循环影响小的特点[3]。周小建等[4]研究显示，依托咪酯能够抑制SCI 后炎性介质水平，进而抑制脊髓继发性损伤。目前依托咪酯对SCI 后脑损伤的保护作用研究少见报道，因此本研究探究依托咪酯对SCI 大鼠的脑保护作用，以期为SCI 后神经功能的恢复治疗提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

62只12周龄SPF级SD雄性大鼠，体重180～220 g，平均（200±20）g，购自北京日新科技有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2021-0260。

1.2 主要试剂及仪器

依托咪酯脂肪乳注射液（江苏恩华药业股份有限公司，国药准字H20020511），白细胞介素1β（Interleukin-1β， IL-1β）、白细胞介素18（Interleukin-18， IL-18）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒（无锡云萃生物科技有限公司），苏木精-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色试剂盒（上海恒斐生物科技有限公司），兔抗鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-bindingoligomerizationdomain-like receptor protein 3， NLRP3）、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）多克隆抗体及山羊抗兔HRP 二抗（艾美捷科技有限公司）。SorvallWX 型超速离心机（北京松信宏泽科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 SCI模型的复制及分组给药大鼠适应性喂养1 周后，参考改良Allen's 法复制SCI 模型大鼠[5]。腹腔注射10%戊巴比妥钠麻醉大鼠，取仰卧位固定于手术台上，背部备皮消毒，沿背部中线逐层剥开皮肤去除T9～T11锥板，以质量为10 g 的打击锤，由5.0 cm 高处自由落下锥击T10脊髓后迅速移开。观察锥击瞬间鼠尾出现痉挛性摆动，双后肢及躯体出现回缩扑动后双后肢出现瘫痪即为模型复制成功。

共复制SCI 大鼠50 只，死亡2 只，成功48 只，随机分为模型组及依托咪酯低、中、高剂量组，每组12 只。另取12 只大鼠作为假手术组，只去除T9～T11锥板，不进行打击锤锥击，其余操作同模型组。

依托咪酯低、中、高剂量组大鼠分别尾静脉注射0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg 依托咪酯脂肪乳注射液[6]，1 次/d，连续4 周；假手术组和模型组大鼠同时间尾静脉注射等量生理盐水。

1.3.2 评估各组大鼠神经行为学各组大鼠治疗4 周后，观察大鼠行走，髋、膝、踝关节的协调情况，观察时间4 min[7]，采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分观察大鼠神经行为学，分值为0～21 分，0 分表示大鼠神经行为功能完全丧失，21 分表示神经行为功能完全正常。

1.3.3 样本采集第4 周神经行为学评估结束后，采集各组大鼠脑脊液[8]。采用10%戊巴比妥钠麻醉大鼠后固定在脑立体定位仪上，剪开头颈部皮肤找到寰枕。通过PE 连接管将150 μL 微量进样器与植入式套管连接在一起，套管穿刺枕大池，抽取150 μL 脑脊液用于ELISA 检测。

将各组大鼠断颈处死，取损伤区脊髓组织分成3 部分，其中一部分置于甲醛固定，乙醇脱水、透明、石蜡包埋过夜，连续切片（6 μm 厚），用于HE染色；另两部分保存于液氮中，分别用于实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western blotting 检测。

1.3.4 ELISA 检测各组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18用人工脑脊液对样本进行等量稀释，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，测定各组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18 水平[9]。

1.3.5 HE 染色观察各组大鼠脊髓组织病理学变化取1.3.3 中各组大鼠部分脊髓组织切片，脱蜡水化进行HE 染色，以中性树胶封片，光学显微镜下观察组织病理学变化并拍照。

1.3.6 qRT-PCR 检测各组大鼠脊髓组织NLRP3、Caspase-1 mRNA 的表达提取1.3.3 中各组大鼠部分脊髓组织总RNA 并测浓度，以RNA 为模板逆转录为cDNA，进行qRT-PCR 反应[10]。总反应体系20 μL：ULtraSYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向游引物各2.0 μL、去离子纯化水4.0 μL。反应条件：95℃预变性15 s、60℃变性60 s，共40 个循环。熔解曲线：60℃至95℃，每15 秒升温0.3℃。qRT-PCR 引物由上海韵泰信息科技有限公司设计并合成，引物序列见表1。以β-actin为内参， 采用2-ΔΔCt法计算NLRP3、Caspase-1 mRNA 相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 测定各组大鼠脊髓组织NLRP3/Caspase-1通路蛋白的表达从液氮中取出剩余部分脊髓组织，制备组织匀浆，加入裂解液并依据蛋白提取试剂盒提取组织总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度及纯度，电泳、转膜、封闭，加入一抗NLRP3、Caspase-1 及内参β-actin，1∶500 稀释，4℃过夜，加入HRP 标记的山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h。显色、成像，计算蛋白相对表达量[11]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经行为学评分比较

假手术组、模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠BBB 评分分别为（25.06±3.76）分、（9.87±1.47）分、（13.43±2.05）分、（16.95±2.55）分和（19.87±2.95）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=57.460，P=0.001）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠BBB 评分降低（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高剂量组大鼠BBB 评分高于模型组（P＜0.05），具有剂量依赖性。

2.2 各组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18水平比较

假手术组、模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18 水平升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18 水平低于模型组，具有剂量依赖性。见表2。

表2 各组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18水平比较（n=12，pg/mL，±s）

表2 各组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18水平比较（n=12，pg/mL，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与依托咪酯低剂量组比较，P ＜0.05；④与依托咪酯中剂量组比较，P ＜0.05。

IL-18 265.78±38.96 965.82±145.87①813.25±121.98①②605.68±90.08①②③423.69±63.56①②③④96.635 0.000组别假手术组模型组依托咪酯低剂量组依托咪酯中剂量组依托咪酯高剂量组F 值P 值IL-1β 172.36±25.83 1 506.25±150.23①1 211.77±181.75①②825.69±123.85①②③512.75±75.89①②③④220.049 0.000

2.3 各组大鼠脊髓组织病理学变化

假手术组大鼠脊髓结构完整清晰，细胞形态正常且分布均匀；模型组大鼠脊髓组织内有大量空腔，脊髓结构紊乱且有大量炎症细胞浸润，脊髓神经细胞出现水肿坏死；与模型组比较，依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓结构紊乱稍减轻，炎症细胞浸润减少，且水肿坏死脊髓神经细胞减少，此种变化程度随浓度增加而更明显。见图1。

图1 各组大鼠脊髓组织病理学变化 （HE染色×400）

2.4 各组大鼠脊髓组织NLRP3 和Caspase-1 mRNA相对表达量比较

假手术组、模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓组织NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓组织NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相对表达量升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓组织NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相对表达量低于模型组（P＜0.05），具有剂量依赖性。见表3。

表3 各组大鼠脊髓组织NLRP3和Caspase-1 mRNA相对表达量比较 （n=12，±s）

表3 各组大鼠脊髓组织NLRP3和Caspase-1 mRNA相对表达量比较 （n=12，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与依托咪酯低剂量组比较，P ＜0.05；④与依托咪酯中剂量组比较，P ＜0.05。

Caspase-1 mRNA 1.01±0.16 2.11±0.32①1.95±0.29①②1.63±0.25①②③1.28±0.18①②③④40.745 0.000组别假手术组模型组依托咪酯低剂量组依托咪酯中剂量组依托咪酯高剂量组F 值P 值NLRP3 mRNA 1.00±0.15 2.35±0.36①2.06±0.31①②1.67±0.26①②③1.33±0.19①②③④50.225 0.000

2.5 各组大鼠脊髓组织NLRP3/Caspase-1 通路蛋白相对表达量比较

假手术组、模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓组织NLRP3 和Caspase-1 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓组织NLRP3 和Caspase-1 蛋白相对表达量升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓组织NLRP3 和Caspase-1 蛋白相对表达量低于模型组（P＜0.05），具有剂量依赖性。见表4和图2。

图2 各组大鼠脊髓组织NLRP3/Caspase-1通路蛋白的表达

表4 各组大鼠脊髓组织NLRP3/Caspase-1通路蛋白相对表达量比较 （n=12，±s）

表4 各组大鼠脊髓组织NLRP3/Caspase-1通路蛋白相对表达量比较 （n=12，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与依托咪酯低剂量组比较，P ＜0.05；④与依托咪酯中剂量组比较，P ＜0.05。

Caspase-1蛋白0.31±0.05 1.17±0.17①0.92±0.14①②0.73±0.11①②③0.45±0.07①②③④106.606 0.000组别假手术组模型组依托咪酯低剂量组依托咪酯中剂量组依托咪酯高剂量组F 值P 值NLRP3蛋白0.25±0.04 1.28±0.18①1.05±0.16①②0.72±0.11①②③0.51±0.08①②③④130.348 0.000

3 讨论

SCI 是临床常见的中枢神经系统疾病，具有较高发生率、致残率，低病死率及年轻化的特点，目前临床仍无有效治疗手段，患者近期及远期疗效均不理想[12]。有研究表明，SCI 病理生理机制复杂，且SCI 往往导致损伤节段以下的神经行为功能障碍，严重影响患者生活质量，给社会及家庭造成沉重负担[13]。因此探寻有效治疗药物及新型治疗靶点对改善患者预后具有较大意义。依托咪酯是一种非巴比妥类催眠性静脉全身麻醉药物，是咪唑类衍生物，安全性大，是常用的麻醉诱导药物之一[14]。有研究结果显示，依托咪酯能够改善颈髓损伤患者脊髓部分功能，提高患者生活质量[15]。

BBB 评分主要是针对截瘫平面以下的神经运动功能进行评价，用于SCI 大鼠后肢运动功能恢复过程评价，反映SCI 病情严重程度[16]。本研究复制SCI 大鼠模型后，与假手术组比较，模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠BBB 评分降低，但依托咪酯低、中、高剂量组大鼠BBB 评分高于模型组，具有剂量依赖性，说明依托咪酯可能对SCI 大鼠中枢神经系统具有保护作用，即发挥脑保护作用，进而有助于脊髓神经运动功能的再生及恢复。有研究表明，早期微循环障碍所致炎症级联反应可能在继发性SCI 中发挥关键作用；IL-1β、IL-18均是具有多种生物学功能的炎症细胞因子，可促进神经元及神经胶质细胞凋亡，进而加重SCI 继发性损伤[17]。锁志刚等[18]研究显示，IL-18 在SCI 大鼠脊髓组织中高表达，促进SCI 继发性损伤。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18 水平升高；但依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脑脊液IL-1β、IL-18 水平低于模型组，具有剂量依赖性，说明依托咪酯可能通过抑制炎症反应进而发挥脑保护作用。

NLRP3 是一种多蛋白复合物，NLRP3 炎症小体受到刺激后可剪切Caspase-1，促使Caspase-1 活化，活化的Caspase-1 进一步活化下游蛋白，进而促使大量炎症因子如IL-1β、IL-18 等释放，加重炎症反应[19]。蒋伟宇等[20]研究显示，抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，可促进SCI 兔神经功能的恢复。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组及依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓组织NLRP3和Caspase-1 蛋白相对表达量升高；但依托咪酯低、中、高剂量组大鼠脊髓组织NLRP3 和Caspase-1 蛋白相对表达量低于模型组，具有剂量依赖性。说明依托咪酯可能通过抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，抑制炎症反应，进而发挥脑保护作用。

综上所述，依托咪酯发挥SCI 脑保护作用可能是通过抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，抑制炎症反应实现的。然而本研究并未能明确依托咪酯对NLRP3/Caspase-1 通路的具体调控作用，后期应进行深入阐述。