宁夏地区规模牧场金黄色葡萄球菌的分离鉴定与药敏试验

张立强，雷 静

宁夏农垦贺兰山奶业有限公司，宁夏银川 750011

0 引言

在奶牛养殖业中，乳房炎是奶牛最常见的疾病之一，根据发病原因可以分为环境性乳房炎和传染性乳房炎。传染性乳房炎通常由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等细菌导致[1]，其中金黄色葡萄球菌引起的乳房炎导致的奶牛死淘率最高且治疗困难，给养殖业造成了极大损失[2]。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中的空气、土壤、水等环境中[2]。研究表明，由金葡菌引起的奶牛乳房炎感染情况仅低于大肠杆菌[3，4]。金黄色葡萄球菌可以损害乳房上皮细胞和腺泡的功能，使奶产量迅速下降，严重威胁奶牛健康和牧场的经济效益。此外，金黄色葡萄球菌也可经伤口进入犊牛血液，导致犊牛发生菌血症，感染眼部发生结膜炎[6]，严重时可透过血脑屏障导致犊牛发生脑膜炎[5]。为此，本研究通过流行病学调查、实验室诊断及分子生物学鉴定等方法对宁夏地区的规模牧场进行金黄色葡萄球菌流行情况的调查，并对分离菌进行了耐药性分析，为宁夏地区金黄色葡萄球菌导致乳房炎的预防提供合理的用药指导。

1 材料

1.1 试剂

LB肉汤培养基、甘露醇高盐琼脂培养基、革兰氏染色液，珠海贝索生物技术有限公司；2×TaqPlus Master mix Ⅱ，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Trans DNA Maker Ⅰ，北京全式金生物技术有限公司；SuperRde核酸染液，合肥兰杰柯科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，京天根生化科技有限公司；药敏试纸，杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 仪器

光学显微镜，Olympus公司；高压灭菌器，Hirayama公司；电子分析天平、电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；超净工作台，上海鸿都电子科技有限公司；离心机，Sigma公司；隔水式恒温培养箱、全自动振荡培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；PCR扩增仪，Techne公司；电泳仪，北京市六一仪器厂；牛博士Ⅲ型体细胞检测仪器，华诚睿光（中国）生物科技有限公司。

2 方法

2.1 样品采集

2021年7—10月，从宁夏地区银川市、石嘴山市、吴中市、中卫市的6 个存栏2 000 头以上的规模牧场中采集奶样856 份，见表1。

表1 各牧场采集的奶牛头数

具体步骤：根据各牧场的DHI数据和牧场管理软件系统，筛选出体细胞数≥300 万个/mL的临床型乳房炎奶牛进行奶样采集，-4 ℃保存运输。

2.2 金黄色葡萄球菌的分离

取50 μL充分混匀的奶样，无菌接于含有1 mL的LB肉汤培养基的试管中，180 r/min、37 ℃振荡培养18~24 h后，划线于甘露醇高盐琼脂培养基，挑取形态相似的菌落接种于1 mL的LB肉汤培养基内，进行纯化，2 次后，挑取单菌落、进行涂片、革兰氏染色，显微镜下观察。

2.3 PCR 鉴定

将菌落形态与金黄色葡萄球菌描述一致，且镜检观察结果为革兰氏阳性球菌的菌液样品按照DNA提取试剂盒描述步骤进行DNA提取。金黄色葡萄球菌特异性鉴定引物反应条件参考相关文献[7]，见表2。

表2 PCR扩增条件及引物序列

2.3 分离菌株的药物敏感性试验

采用革兰氏阳性球菌敏感性药物头孢噻肟、青霉素、万古霉素、链霉素、庆大霉素、诺氟沙星、丁胺卡那霉素、氨苄西林、四环素、阿莫西林、环丙沙星等。取50 μL纯化后的金黄色葡萄球菌菌液滴在贴有7 种不同药敏纸片的LB琼脂培养基上，每个药敏纸片之间的距离≥24 mm，置于37 ℃恒温培养箱中培养18~24 h后进行观察，并测量LB琼脂平皿上形成的抑菌环大小。细菌对每种药物的敏感程度按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）药敏试验标准进行判断。

3 结果与分析

3.1 金黄色葡萄球菌鉴定结果

甘露醇高盐培养基为金黄色葡萄球菌选择培养基，在该平皿上长出的为金黄色葡萄球菌菌落（图1）。金黄色葡萄球菌经革兰氏染色后，在显微镜下可以观察到排列呈葡萄串状，无芽孢、鞭毛、荚膜的革兰氏阳性球菌（图2）。

图1 甘露醇高盐琼脂培养基

图2 金葡菌镜检图片（1 000×）

3.2 PCR 鉴定结果

6 个规模牧场所采集的856 份奶样经PCR鉴定为金黄色葡萄球菌的共有467 株。其中A场73 株、B场67 株、C场77 株、D场82 株、E场93 株、F场75 株。扩增所产物大小与预期一致，为233 bp（图3）。

3.3 药物敏感性试验结果

金黄色葡萄球菌对环丙沙星、万古霉素、庆大霉素、头孢噻肟、阿莫西林、链霉素高度敏感（表3）。

表3 不同药物对金黄色葡萄球菌的平均抑菌直径

4 讨论

金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎防控的瓶颈是每次治疗都可导致大量耐药性菌株的出现，因此检测菌株对药物的敏感性可以为兽医工作者选择适合的治疗药物提供有效的依据[8]。乳房炎在牧场中是非常常见的疾病，使用合理，科学的方案进行预防、治疗乳房炎显得非常重要，如治疗时应选择高度敏感性药物并且轮换使用，以此来减少耐药性的发生[9，10]。为了降低乳房炎造成的经济损失，牧场应加强饲养管理，定期对圈舍环境消毒，保证垫草干燥，提供高质量、营养全面的饲料。

本次试验共采集奶样856 份，其中经革兰氏染色和显微镜镜检后革兰氏阳性球菌共811 株，分离率达95 %，通过PCR鉴定共得到金黄色葡萄球菌467 株，阳性率达55%；药敏试验结果显示，分离出的金黄色葡萄球菌对环丙沙星、万古霉素、庆大霉素、头孢噻肟、阿莫西林、链霉素敏感，可以作为首选药物，为宁夏地区牧场预防金黄色葡萄球菌乳房炎提供了科学的依据。