长沙烟区氮肥用量对烤烟品质及土壤微生物的影响

姚未远，张文军，刘优雄，周喜新，刘 琪，夏 滔，何激光，杨 柳

（1. 湖南省烟草公司长沙市公司宁乡市分公司，湖南 宁乡 410600；2. 湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

氮磷钾是植物生长过程中最重要的3 种元素，其中氮元素在植物体内参与多种生理过程，氮含量的多少将影响烤烟植株体内蛋白质、酶、叶绿素和烟碱等重要成分的含量[1-2]。施氮量对烤烟生长发育起着关键作用。适宜的氮肥施用量可以促进烤烟烟叶的生长，延缓叶片贪青晚熟，显著提升烟叶质量[3-4]。氮肥施用量不足，烤烟植株的株高、叶片大小都会下降，烟叶品质较差[5-6]。因此，烤烟生育期内适宜的土壤氮素供应是保障优质烟叶生产的重要前提，土壤氮元素供应与烟株氮素吸收不协调已经逐渐成为限制优质烟叶原料产出的主要因素[7]。

根际土壤微生物是随着植物生长发育在土壤中逐渐形成的微生物群落[8]。根际土壤微生物中含有大量的可以促进植物生长的有益菌种——根际促生菌（PGPR）。PGPR 具有促进土壤中各类养分转化、减少土壤中病原菌数量以及减少土壤污染等重要作用[9]。

长沙市地处洞庭湖以南地区，地貌以山地、丘岗、平原为主，属于亚热带大陆性季风气候，拥有四季分明、冬短夏长的气候特征，具备优质烤烟生长发育的良好生态条件，是湖南省主要的烤烟种植区。研究以云烟87为供试烤烟品种，通过设置不同施氮水平，研究了氮肥用量对烤烟生长期间氮素转化、烤后烟叶主要化学成分和根际土壤微生物多样性的影响，以期通过优化氮肥投入、建立适宜于烟区优质烟叶生产的土壤-烤烟-氮素综合管理措施，实现长沙烟区氮素高效利用与优质烟叶生产的目标。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

试验于2021 年3—8 月在湖南省长沙市宁乡市大屯营乡开展，选取光照充足、排灌便利、往年无土传病害的代表性优质烟叶生产田块（烟叶产量为140～175 kg/667m2）作为试验田，供试烤烟品种为云烟87。供试氮、磷、钾肥分别为提苗肥、磷酸二氢钾、硝酸钾、硫酸钾。

1.2 试验设计

根据宁乡市优质特色烤烟生产技术方案，推荐施氮量为9.14 kg/667m2（基肥+追肥），设置4 组氮肥追施量处理，不改变各处理基肥施用量，分别为：CK，基施氮肥6.14 kg/667m2，不追施氮肥；T1，7.14 kg/667m2（基肥+追肥）；T2，8.14 kg/667m2（基肥+追肥）；T3，9.14 kg/667m2（基肥+追肥）；每处理设置3 组重复，每个处理面积为667 m2。各处理后期不施氮肥，磷、钾肥采用过磷酸钙、重钙、磷酸二氢钾、硫酸钾等肥料替代原使用的提苗肥和硝酸钾产品。在烤烟生长的旺长期、现蕾打顶期、成熟采烤期对烟株地上部进行采集底脚叶、花蕾及腋芽等样品，成熟采烤期分上、中、下部叶3 次采收烟叶。同时，分别在烤烟生长的旺长期、现蕾打顶期、成熟采烤期采集烟株根际土壤样品，在离烟株5 cm 处利用土钻采集0～15 cm 耕层土壤，选取每个处理所在田块6 个不同点进行取样，约500 g。

1.3 烤烟样品测定指标及方法

取新鲜植株样品，分成茎、叶2 部分，105℃杀青30 min 后，65℃烘干粉碎后测定其干物质重及氮含量，植株含氮量采用凯氏定氮法测定。

各小区烟叶采收后按三段式烘烤法烘烤，按烤烟42 级国家标准（GB 2635—92）分级，并测定各小区烟叶产量，同时每个小区分别取X2F、C3F、B2F 这3 个等级的烟叶各1.5 kg，按照国标分别测定烟叶氮、钾、氯、烟碱、淀粉、总糖、还原糖、蛋白质等化学成分含量。

1.4 土壤样品采测定指标及方法

在烤烟成熟采烤期取烟株根际土壤，将土壤中砾石、植物组织等分离后放入做好标记的50 mL 离心管中，-80℃保存。

采用DNA 抽提试剂盒对样本的基因组DNA 进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000 检测提取的DNA 浓度。以基因组DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode 的特异引物、Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase 进行PCR，确保扩增效率和准确性。PCR 产物使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后的PCR 产物作为二轮PCR 的模板，进行二轮PCR 扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对 PCR 产物进行Qubit 定量，根据PCR 产物浓度进行等量混样，并上机测序。

1.5 生物多样性分析

根据基因测序结果，获得根际土壤微生物群落的OTUs 数据，依据OUTs 数据的Alpha 多样性可以表示特定区域内或生态系统的多样性，该研究通过Chao1、Shannon、ACE、Simpson、Observedspecies、Coverage 等度量指标来评价物种的丰富度及物种多样性。其中Chao1 和Observedspecies 指数值越高，表明根际土壤微生物群落物种丰富度越高；Shannon 和Simpson 指数值越高，表明根际土壤微生物群落物种的多样性越高。

2 结果与分析

2.1 不同施氮量对烤烟生长期间植株含氮量的影响

由表1 可知，不同时期各处理烤烟不同部位含氮量不同。在旺长期，烤烟植株含氮量随氮肥用量增加而显著增加，T3 处理烟茎和烟叶的含氮量最高；而在打顶期，各处理烤烟植株含氮量随氮肥用量的增加呈现先增加后下降的趋势，以T2 处理中烟茎和烟叶的含氮量最高；在成熟期时，T3 处理烟茎含氮量最高，而烟叶含氮量以T2 处理最高。总体来看，T3 处理烤烟在旺长期氮素养分储存最好，T2 处理烤烟在打顶期和成熟采烤期氮素养分储存最好。

表1 不同施肥处理对烤烟不同时期含氮量的影响 （%）

2.2 不同施氮量对烤后烟叶主要化学成分影响

由表2 可知，对于下部叶来说，T2 处理烤烟的总糖、还原糖含量最高，氯含量最低；T3 处理的全氮、总蛋白、钾含量最高，钾氯比最高；T1 处理的糖碱比最高；综合对比，T2、T3 处理有利于烤烟下部叶中各类化学成分合成。对中部烟叶来说，T2 处理烤烟的总糖、还原糖、烟碱含量最高，氯含量最低，总糖烟碱比最高；T3 处理烤烟的全氮、总蛋白、钾含量最高，钾氯比最高；综合比较，T2 处理有利于烤烟上部叶中各类化学成分合成。对上部烟叶来说，T2处理烤烟的总糖、烟碱、总蛋白、钾含量最高，钾氯比最高；T3 处理烤烟的全氮含量最高，氮碱比最高；总体来看，T2处理的烤烟上部叶中各类化学成分协调，品质较好。

表2 不同施氮量对烤烟化学成分的影响

2.3 不同施氮量对烤烟根际土壤微生物数量的影响

由图1 可知，在属水平上，CK、T1、T2、T3 处理的细菌OTUs 数量分别为1 734、2 289、2 816 和2 345；与CK 相比，T1、T2、T3 处理烤烟根际土壤微生物细菌OUTs 数量显著增加，其中T2 处理增加最显著。CK、T1、T2、T3 处理的真菌OTUs 数量分别为297、244、236 和197；与CK 组相比，T1、T2、T3 处理烤烟根际土壤微生物中真菌OTUs 数量显著下降，其中T3 处理下降最显著，其原因可能是过量的氮肥施用影响了真菌的生长繁殖。

图1 不同施氮量处理烤烟根际土壤微生物属水平的数量

2.4 不同施氮量对烤烟根际土壤微生物群落多样性的影响

由表3 可知，与CK 相比，T1、T2、T3 处理的Chao1、Observed species、Shannon 和Simpson 值显著提高，且T2 处理的指数提高最显著，表明适宜的施氮量可以有效提高烤烟根际土壤微生物的物种丰富度和群落多样性。

表3 不同施氮量处理烤烟根际土壤微生物的Alpha多样性指数

3 结论与讨论

烤烟的产质量与其种植过程中氮肥的施用量紧密相关[10-12]。宁乡烟区大田试验结果表明，T2 处理（8.14 kg/667m2）烤烟在打顶期和成熟期时，烟茎和烟叶中的氮元素储存量最高。有研究表明，烤烟生长发育时期，植株内氮元素的含量对烤烟的生长发育起着至关重要的作用[13]。

烤后烟叶中各项化学成分是影响烤烟品质的主要因素，烟叶中总糖和还原糖的含量对吃味影响较大[14]。较低的总糖、还原糖含量导致烟叶的吃味较淡，较高的总糖、还原糖含量导致烟叶的吃味平和；烟叶中的蛋白质含量越高烟叶等级越低；钾元素和氯元素含量共同影响烟叶的燃烧性，氯元素过多时烟叶中的香气质量会下降[15-16]。牛德新等[17]等研究发现，施用过量的氮肥，烟叶中总糖、还原糖含量会有所降低。在笔者的研究中，综合3 个部位烟叶各项化学指标来看，T2处理的烤后烟叶各项化学成分趋于协调，品质较好。适宜的施氮量会增加烤后烟叶的总糖、还原糖、烟碱、总蛋白和钾的含量，降低氯元素的含量。

根际土壤微生物的变化，对植物的生长发挥着重要作用，不同施氮量处理会对烤烟根际土壤微生物产生影响，而根际土壤微生物会反作用于烤烟植株[18]。微生物群落中的根际促生菌（PGPR）是具有促进植物健康生长的重要菌群[19-20]。经研究发现，T2 处理可以有效提高根际土壤微生物的数量以及根际土壤微生物群落的物种丰富度和多样性，有利于促进烤烟的生长发育。