光催化氧化荧光衍生法检测叶酸

吴 姝， 陈 思， 胡 琪， 曹 烁， 曾鸿林， 陈 芳*

(华中科技大学化学与化工学院，生物无机化学与药物湖北省重点实验室，湖北武汉 430074)

叶酸(Folic Acid,FA)是一种水溶性维生素，由6-甲基蝶呤(MEP)残留物、对氨基苯甲酸(PABA)残留物和谷氨酸(Glu)残留物三个部分组成。叶酸在许多生理化过程中起着非常重要的作用[1]。怀孕初期的妇女每天补充400 mg叶酸可以减少婴儿神经管缺陷和先天畸形的风险[2]。缺乏叶酸则会导致贫血，并增加心脏病发作的可能性[3]。另一方面，叶酸无法从体内的新陈代谢中合成，只能从饮食中获取。叶酸在光照、受热下易氧化分解，而且在食品加工过程中极易造成损失[4]。因此，提出一种简单、快速的分析方法用于食品或药剂中叶酸的检测具有十分重要的实际意义。

目前，有多种方法可以用于测定食品或药剂中叶酸的含量，包括电化学法[5]、化学发光法[6]、荧光法[7]、高效液相色谱法[8]、分光光度法[9]等。其中，荧光法具有响应速度快、选择性高的优势。Elisabet等人[10]提出了一种在线柱后光衍生化的液相色谱法分析叶酸及其两种主要代谢物，但该方法检测仪器贵重且需使用有机溶剂做流动相。Su[11]利用Fenton试剂作为氧化剂，建立了测定叶酸含量的间接荧光法。这些基于化学氧化的荧光衍生法通常需要加入过量的氧化剂，其氧化程度不可控。光催化技术是一种高级氧化技术，仅利用极其丰富、无污染和安全的太阳能，就可以实现对有机物的氧化。目前光催化技术在光催化制氢[12]、污染物的降解[13]等领域得到了广泛应用。光催化纳米材料大多是金属氧化物或硫化物等半导体材料，其中纳米TiO2以其无毒、成本低、物理和化学稳定性好，以及独特的电子和光学性能受到了研究者们的极大关注[14]。将光催化氧化与荧光衍生结合可避免二次污染，提高氧化效率，同时氧化程度可控。目前，基于光催化的荧光衍生往往被用于检测活性氧化物种，评价材料的光催化性能[15]，而用于化合物的检测鲜有报道。

本文以纳米TiO2为光催化剂，将光催化技术与荧光分析法相结合，建立了一种新的用于药物中叶酸检测的荧光分析新方法。在紫外灯的照射下，纳米TiO2产生的羟基自由基氧化叶酸生成强荧光的蝶啶类物质6-甲酰基蝶呤(6-FOP)。通过叶酸浓度与溶液荧光强度之间的线性关系，实现对叶酸含量的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LS -55型荧光分光光度计(美国，珀金埃尔默股份有限公司)。UV2600型紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)。FA1104B型电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。KQ-50E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。85-1 A型磁力搅拌器(上海东玺制冷仪器设备有限公司)。液相色谱仪和质谱仪(德国，安捷伦科技有限公司)。

叶酸(FA，上海伯奥生物科技有限公司)；三羟甲基胺基甲烷(上海如吉生物科技发展有限公司)；NaH2PO4(上海强顺化工有限公司)；NH4Ac(上海山浦化工有限公司)；NH3·H2O、纳米TiO2(P25)、NaAc·3H2O、Na2HPO4·12H2O、HCl、甲醇均购买自国药集团化学试剂有限公司，所有试剂均为分析纯。实验用水为去离子水。

1.2 叶酸的检测

将0.0500 g叶酸溶于一定量NH3·H2O中，用去离子水定容至100 mL，得到0.500 g/L的叶酸储备溶液。称取0.0500 g纳米 TiO2至50 mL容量瓶，定容得到纳米TiO2为1.00 g/L的乳白色悬浊液。向小烧杯中分别加入1.00 mL一定浓度的叶酸溶液，1.00 mL 0.100 mol/L pH=4.2的HAc-NaAc缓冲溶液，100 μL纳米TiO2悬浊液和7.90 mL去离子水。将混合溶液置于紫外灯下磁搅拌5 min，以增大纳米TiO2的光接触面积，提高氧化效率。在室温下，用0.22 μm 的滤膜过滤混合溶液，然后以280 nm为激发波长，测定440 nm波长处滤液的荧光强度。

1.3 液相色谱/串联质谱条件

色谱柱为C18柱，柱温度设置为30 ℃。流动相为30%甲醇和70% 0.01 mol/L NH4Ac，流速为1 mL/min。进样量为20 μL。用高纯度氮气作为内充气体，干燥温度设置为200 ℃。质谱采用正离子模式进行分析，扫描范围为m/z50～1 200。

1.4 实际样品预处理

斯利安叶酸片购买自某一药房。将一片叶酸片研磨成粉末状，溶于去离子水中并定容至100 mL,在室温下超声处理10 min，用分液漏斗过滤，静置一段时间后，取上清液做为样品溶液，置于冰箱中备用。为了防止叶酸被破坏，整个操作过程都是在弱光下进行。

2 结果与讨论

2.1 叶酸检测系统的建立

分别测量了1.00 mg/L的叶酸溶液直接光氧化前后，以及光催化氧化后的荧光激发光谱和荧光发射光谱。如图1所示，叶酸自身几乎没有荧光，在紫外光下直接光氧化5 min后，叶酸的荧光信号增强，最大激发波长和发射波长分别为280 nm和440 nm。而光催化氧化后，叶酸溶液的荧光强度大约为光直接氧化的5倍，且最大激发和发射波长不变。结果表明，相比于光直接氧化，光催化剂的引入极大提高了叶酸的荧光衍生程度。因此，光催化氧化荧光衍生叶酸可用于构建叶酸的荧光分析方法。

图1 叶酸氧化前(a1)、光氧化后(a2)、光催化氧化后(a3)的荧光激发光谱以及叶酸氧化前(b1)，光氧化后(b2)和光催化氧化后(b3)的荧光发射光谱

2.2 荧光衍生条件

2.2.1 缓冲溶液及pH影响考察了Tris-HCl缓冲溶液、HAc-NaAc缓冲溶液和磷酸盐缓冲溶液(PBS)，以及其pH值对叶酸氧化产物荧光的影响，发现在PBS和Tris-HCl缓冲溶液中，叶酸氧化产物的荧光较弱；以HAc-NaAc缓冲溶液调节pH，pH=4.2时，荧光强度最大且稳定，见图2(A)。这可能是由于溶液酸度影响了叶酸分子中氨基的质子化以及羧基的电离程度；也可能是因为在碱性条件下，由于纳米TiO2表面负电荷和溶液中高浓度OH-，抑制了TiO2内部的光生电子向催化剂表面的转移过程，促进了光生电子-空穴的复合[16]，影响光催化氧化效率。实验选择pH=4.2的HAc -NaAc缓冲溶液。

2.2.2 纳米TiO2加入量影响图2(B)为纳米TiO2含量对荧光强度影响。可以看出，对1.00 mg/L叶酸，纳米TiO2为0.010 g/L时荧光最强。纳米TiO2的适量增加可以提供更多的反应活性位点和光活性物质，促进叶酸氧化过程。过量纳米TiO2粒子将掩盖一部分光敏表面，影响紫外光的穿透，阻碍内部溶液对光的吸收；也可能由于过量纳米TiO2表面光反射率增加，导致光催化效率的降低[17]。选择0.010 g/L纳米TiO2。

2.2.3 光照时间的影响光照时间对荧光强度的影响如图2(C)所示。随光照时间增加，叶酸的荧光强度随之增加，这表明可以通过控制光催化时间来控制荧光衍生程度。综合考虑检测灵敏度和检测时间，光照时间选择5 min。

图2 pH(A)、TiO2加入量(B)和光照时间(C)对溶液荧光强度的影响

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围、检出限和重现性图3为叶酸质量浓度与荧光强度的标准曲线，在0.001～1.300 mg/L范围内，叶酸浓度与440 nm处荧光强度有良好的线性关系，线性方程式为：F=323c+0.497(F：荧光强度，c:mg/L),相关系数R2= 0.9960。以3倍信噪比(S/N=3)计算，该方法检出限为 0.348 μg/L。10次独立测定的相对标准偏差(RSD)为0.87%，表明方法有良好重现性。

图3 叶酸浓度与荧光强度的标准曲线图

与一些其它的叶酸检测方法相比较(表1)，本方法在无需使用贵金属、无需复杂的合成或操作步骤的前提下，具有更宽的线性范围和更低的检出限。

表1 测定叶酸的分析方法比较

2.3.2 抗干扰能力为了检测该方法的抗干扰性能，测定了某些干扰物质对荧光强度的影响，实验结果如图4所示。2.27×10-4mol/L葡萄糖、L-半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、MgSO4、KCl、CaCl2，1.13×10-4mol/L的牛血清白蛋白和1.13×10-5mol/L的色氨酸等都对检测结果没有明显的影响。2.27×10-5mol/L的Cu(NO3)2和1.13×10-5mol/L抗坏血酸对叶酸荧光强度有一定的抑制作用，可能是由于Cu2+被光生电子还原后生成的Cu+对叶酸的氧化过程产生影响，而抗坏血酸为强自由基捕获剂，捕获了光催化产生的羟基自由基，导致叶酸的氧化程度降低。因此，该方法有较好的抗干扰能力。

2.4 实际样品的测定

将预处理后的叶酸片溶液，经上述方法荧光衍生后，测定440 nm处的荧光强度，并进行了加标回收实验，每组平均测定3次。具体结果如表2所示。实验测得叶酸片中叶酸含量为0.401 mg/粒(标注的含量：0.40 mg/粒)。相对标准偏差(RSD)在0.33%～1.26%之间。表明该方法有较高的精确度和较好的重现性，可以应用于实际样品中叶酸的定量测定。

2.5 机理探讨

测定了叶酸氧化前后的液相色谱/串联质谱图。图中出现的m/z192.0对应于6-甲酰基蝶呤(6-FOP)，该氧化产物与文献报道[22,23]的叶酸的降解产物基本一致。叶酸本身几乎没有荧光，当MEP部分被紫外光激发时，电子会从PABA环转移到MEP部分，导致分子内荧光“自猝灭”[24]。光催化氧化导致MEP与PABA之间的C-N键断裂，分子内的光诱导电子转移(PET)效应消失，体系荧光显著增强。溶液中被氧化MEP部分可进一步光敏化叶酸分子的氧化反应[25]，使叶酸的荧光衍生效率大大提高。

3 结论

建立了一种基于光催化的快速、经济、灵敏度高的检测叶酸的荧光分析法。一定条件下，荧光强度和叶酸的浓度具有良好的线性关系，可以用于分析叶酸片中叶酸的含量。光催化氧化与荧光分析法的结合是样品分析中一个全新的检测方法，可以用于各种氧化后可产生荧光的物质的分析。此外，可以通过掺杂其他原子来增大纳米TiO2的表面空隙，防止电子-空穴对复合，提高该方法的氧化效率；也可以进一步通过表面修饰提高氧化的选择性和抗干扰能力等。