手性配位交换色谱法拆分普卢利沙星对映体

陈 希， 鄢雷娜， 刘绪平， 肖钦钦， 段和祥， 陈伟康*

(江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌 330029)

药物分子的手性与药物的药理活性、毒性及药代动力学性质有着密切关系。当手性药物的对映体进入生物体内，将作为不同的分子加以识别匹配，因此对映体在药效学、药动学和毒理学方面存在立体选择性，致使其生物活性、代谢过程及毒性方面均可能存在明显差异，最典型的例子为上世纪60年代的“反应停”事件[1,2]。鉴于手性化合物对映体的药理活性和毒性往往有很大差异，开展对映体化学(纯度鉴别、检查等)、药理学、毒理学以及临床应用等研究是非常有必要的，且具有重要意义。然而欲开展这些工作，必须首先解决对映体拆分问题，因此建立手性分离分析方法成为开展手性药物研究过程中的关键一环[3]。

普卢利沙星(Prulifloxacin)是日本新药公司开发研制的第四代喹诺酮类广谱抗生素，该药对革兰氏阴性和阳性菌、厌氧菌、衣原体和支原体等都具有广泛的杀菌和抑菌作用，临床主要用于治疗呼吸道感染、泌尿道感染、皮肤软组织感染[4,5]。普卢利沙星分子结构有一个手性碳，见图1。有报道左旋普卢利沙星及其生理上允许的盐可以替代现有抗菌药物普卢利沙星及生理上允许的盐，其不但抗菌作用明显增强，而且毒性小[6]。为了解药物中左右旋普卢利沙星的比例，有必要建立相应的对映体拆分方法，但目前尚无该药对映体的拆分报道。手性配位交换流动相添加剂法，系在流动相中添加某种手性配体(多采用手性氨基酸)和金属离子，与待测的对映体配位形成两个非对映的三元络合物，在非手性固定相的色谱柱(如C18色谱柱)上进行对映体的拆分[7,8]。已经有文献对莫西沙星、帕珠沙星、氧氟沙星、尤利沙星等手性喹诺酮药物对映体进行了拆分测定[9 - 13]。本文选用L-异亮氨酸和CuSO4作为手性添加剂，使用普通C18色谱柱对普卢利沙星对映体进行拆分研究。

图1 普卢利沙星的化学结构式

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

LC-20AD XR高效液相色谱仪(日本，岛津公司)；MS205DU电子天平(瑞士，梅特勒-托利多公司)。

普卢利沙星对照品(梯希爱化成工业发展有限公司，批号：XM8QF-TS，含量：98.0%)。L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸和L-脯氨酸为生化试剂，甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。水为超纯水。

1.2 溶液配制

称取普卢利沙星对照品105.32 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液(含普卢利沙星1032.1 μg/mL)。取上述溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液1 (含普卢利沙星206.4 μg/mL)。称取普卢利沙星对照品102.12 mg，置于100 mL容量瓶中，加乙腈20 mL使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀。取该溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液2 (含普卢利沙星200.2 μg/mL)，临用新配，4 ℃保存。

1.3 色谱条件

色谱柱：月旭Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：L-异亮氨酸-CuSO4溶液(含8 mmol/L 的L-异亮氨酸和4 mmol/L的CuSO4，用NaOH溶液调节溶液pH至3.5)-甲醇(68∶32，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：276 nm。

2 结果与讨论

2.1 稀释剂和进样体积对拆分的影响

取对照品溶液1，当进样体积为10 μL时，普卢利沙星两个对映体的峰形特别差，理论塔板数(N)和分离度(RS)均不太满意，且有较大的溶剂峰。取对照品储备溶液和对照品溶液2，分别进样2 μL和10 μL，两种方式进样普卢利沙星两个对映体峰间的RS约为3.61和3.78，普卢利沙星峰形几乎无差异，只是乙腈为稀释剂时溶剂峰较大。色谱图见图2。上述差异主要原因可能为乙腈对三元络合物的形成有干扰，乙腈稀释的对照品溶液进样体积减少到2 μL时，普卢利沙星对映体峰形可以得到较好改善。使用流动相稀释时普卢利沙星放置3 h后降解1.8%，而使用乙腈稀释时普卢利沙星几乎不降解，所以如选用流动相稀释时需临用新配。

图2 普卢利沙星对照品的色谱图

2.2 手性流动相添加剂对拆分的影响

不同手性配体的手性拆分能力差异较大，本文分别考察了L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸和L-脯氨酸作为手性配体的拆分情况。选择质量浓度约为1032.1 μg/mL的普卢利沙星对照品储备溶液，进样量2 μL进行实验。结果表明：使用L-脯氨酸时普卢利沙星仅有1个色谱峰，无法拆分普卢利沙星对映体；使用L-苯丙氨酸和L-异亮氨酸时，色谱图中普卢利沙星有2个色谱峰，可以实现普卢利沙星对映体的拆分。L-苯丙氨酸拆分普卢利沙星对映体时保留时间较长，增加甲醇比例至36%，考察普卢利沙星对映体保留时间近似时，两个对映体峰间RS，使用L-异亮氨酸可以获得更佳RS，见表1。

表1 不同手性氨基酸对保留时间和分离度的影响

2.3 L-异亮氨酸浓度对拆分的影响

L-异亮氨酸浓度的增加可以增加流动相中L-异亮氨酸和Cu2+二元络合物的浓度，可使流动相中产生更多的二元络合物用于色谱柱固定相上的分配，进而提高普卢利沙星对映体峰间RS[14]。但由于L-异亮氨酸和CuSO4手性添加剂在276 nm波长也有紫外吸收，L-异亮氨酸浓度过高造成流动相在276 nm吸收值过大(背景吸收)，样品分析时普卢利沙星对映体峰高和峰面积会减少，所以需要找到适宜的L-异亮氨酸浓度。保持L-异亮氨酸和CuSO4浓度比为2∶1，考察L-异亮氨酸浓度为6～12 mmol/L时对普卢利沙星对映体拆分的影响。实验表明L-异亮氨酸浓度为8 mmol/L时有较好RS，峰面积(A)的减少也不太大，结果见表2。

表2 L-异亮氨酸浓度对拆分的影响

2.4 金属离子浓度对拆分的影响

Cu2+与配位体比例的不同，同样会影响对映体拆分效果[15]。维持8 mmol/L L-异亮氨酸浓度不变，探寻最佳Cu2+浓度。结果显示，Cu2+浓度为3 mmol/L时，普卢利沙星对映体峰间RS相比4 mmol/L时只增加了0.1，但是分析时间需要延长到近30 min，结果见表3。综合考虑，最终选择CuSO4的浓度为4 mmol/L。

表3 CuSO4浓度对拆分的影响

2.5 流动相pH对拆分的影响

流动相pH对拆分的影响也很大，呈碱性有利于络合物的形成，一般碱性流动相比酸性时获得更高的容量因子和RS[16]。但流动相pH大于3.5后，Cu2+络合物沉淀产生速度明显加快，所以考察流动相pH在3.0～3.5间变化对拆分的影响。结果显示pH值越大，普卢利沙星对映体峰间RS越大，pH为3.5时具有最好的RS，结果见表4。

表4 流动相pH对保留时间和分离度的影响

2.6 有机改性剂对拆分的影响

不同的有机溶剂对拆分效果也有较大的差异，本实验中使用甲醇可以获得较好的拆分效果。但有机相使用乙腈时无法拆分普卢利沙星对映体，色谱图见图3。

图3 以乙腈为有机相的普卢利沙星对照品色谱图

3 结论

本研究通过优化流动相中配体种类、浓度、比例以及pH等参数，得到了拆分普卢利沙星对映体的最佳流动相组成：8 mmol/L L-异亮氨酸和4 mmol/L CuSO4溶液(pH=3.5)-甲醇(68∶32，V/V)，成功建立手性配位交换色谱流动相添加剂法拆分普卢利沙星对映体的方法。该方法选择性高，前处理简单、经济，容易普及。