c-IAP1和Caspase-3在喉癌及癌旁组织中的表达及临床意义

赵婉彤 崔 颖

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，发生率约占头颈部肿瘤的20%，大部分源于喉黏膜上皮组织，以鳞状细胞癌(LSCC)为主。喉癌是一种受环境和生活方式相关因素影响的多因素疾病[1]。喉癌患者的生活质量虽然随着诊疗水平的提高有所改善，但其3～5年内复发率仍较高，危及患者生命。因此，进一步探讨喉癌的发生发展机制，积极寻找治疗的新靶点，提高喉癌患者的生活质量及生存率已成为新的热点。

细胞凋亡抑制因子(IAPs)是一类调节细胞生存的重要因子[2]，能够阻断细胞凋亡，调节信号转导，影响细胞增殖。c-IAP1是其重要组成成员，作用机制是抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族成员介导的蛋白酶级联反应，通过BIR结构域与相应的Caspase结合，抑制其激活，从而抑制凋亡。Caspase家族是一类独特的半胱氨酸蛋白酶[3]，是哺乳动物凋亡机制的基本组成部分，可作为细胞凋亡或程序性细胞死亡的效应物，其中Caspase-3是调控凋亡最关键的酶之一。细胞凋亡需要Caspase的蛋白水解激活，Caspase被合成为潜在的前体酶。一旦被激活，Caspase就会切割出广泛的分子，最终导致细胞分解。因此，Caspase在细胞内受到严格控制。活性Caspase可以被凋亡抑制因子(IAPs)特异性地抑制。

目前，c-IAP1及Caspase-3已被证实在多种恶性肿瘤的发生和发展中发挥重要作用，但其在喉癌发生发展中的作用尚未见报道。因此，本研究通过免疫组化检测喉癌及其对应癌旁正常上皮组织中c-IAP1和Caspase-3蛋白的阳性表达率，初步探讨了c-IAP1和Caspase-3蛋白与喉癌临床病理特征的关系，并分析上述两种蛋白在喉癌中表达的关联性，以期为喉癌的发生发展提供一个初步的理论依据。

图1 c-IAP1和Caspase-3蛋白在喉癌和癌旁正常组织中的表达(DAB法X200)

1.资料与方法

1.1 一般资料 本研究选取2015年1月至2017年1月锦州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科60例手术切除且病理学诊断为喉鳞状细胞癌患者的石蜡切片及对应癌旁正常上皮组织(距癌肿切缘0.5cm以上，经病理确认)。所有患者均为初次治疗且术前均未行放化疗治疗。其中，男性55例，女性5例，年龄55～70岁，平均年龄64.27岁；TNM分期：T1期9例，T2期25例，T3期19例，T4期7例；喉癌分型：声门上型17例，声门型38例，跨声门型5例；分化程度：高分化30例，中分化25例，低分化5例；术后病理回报有淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者40例。本研究经医院伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书。

1.2 实验试剂 ab108361 Anti-c-IAP1(100μl/支)购自美国Abcam公司，14220T Caspase-3 Antibody(100μl/支)购自美国CST公司，山羊抗兔多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 方法 本研究采用免疫组织化学染色法检测各个组织中c-IAP1及Caspase-3蛋白的表达情况。具体步骤如下：①将恒温箱预热到60℃，放入石蜡切片，烤片1h。②脱蜡：置于二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min。③水化：置于无水乙醇3min(2次)、95%乙醇3min(2次)、90%乙醇3min、85%乙醇3min、蒸馏水1min、PBS溶液洗涤3min(3次)。④热抗原修复：使用微波炉加热。将片子置于柠檬酸盐溶液中，80℃下加热8min，然后放入室温冷却8min，再次于40℃下加热8min，然后冷却至室温。⑤PBS溶液洗涤3min(3次)。⑥擦净片子上的液体，用免疫组画笔画圈。⑦加阻断剂(内源性过氧化物酶阻断剂)，等待10min后，PBS溶液洗涤3min(3次)。⑧加山羊血清封闭(封闭用正常山羊血清工作液)，等待10～15min。⑨滴加一抗(c-IAP1：1：500；Caspase-3：1:100)后放于免疫组化湿盒中，4℃孵育过夜。⑩隔天将片子恢复室温，PBS溶液洗涤3min(3次)。滴加二抗(生物素标记山羊抗兔IgG)，等待10～15min，PBS溶液洗涤3min(3次)。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，等待10～15min，PBS溶液洗涤3min(3次)。显色：滴加DAB溶液，等待5～8min，用自来水冲洗。复染：滴加苏木素，等待20s后自来水冲洗。滴加盐酸乙醇分化液1s后自来水冲洗。脱水：置于95%乙醇2min(2次)、无水乙醇2min(2次)。透明：置于二甲苯2min(2次)。封片：滴上中性树胶，盖上盖玻片，晾干备用。其中阴性对照将一抗替换为0.01MPBS～0.01%Triton液，其他条件保持不变。染色结果在光学显微镜下观察并进行判读。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行分析，计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验或fisher确切概率法，组间关联性采用spearman相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 c-IAP1和Caspase-3在喉癌组织和癌旁正常上皮组织中的表达情况 c-IAP1蛋白在喉癌组织的阳性表达率明显高于癌旁正常上皮组织(P<0.01)，而Caspase-3蛋白的阳性表达率在喉癌组织中明显低于癌旁正常上皮组织(P<0.01)，见表1、表2、图1。

表1 喉癌和癌旁正常上皮组织中c-IAP1的表达 单位：例(%)

表2 喉癌和癌旁正常上皮组织中Caspase-3的表达 单位：例(%)

2.2 c-IAP1和Caspase-3在喉癌中表达情况与临床病理学特征之间的关系 在60例喉鳞癌患者中，c-IAP1和Caspase-3蛋白的表达与吸烟、饮酒、分化程度、淋巴结转移、TNM分期具有相关性(P<0.05)，而与年龄、性别、临床分型无相关性(P>0.05)，见表3。

表3 喉癌组织中c-IAP1和Caspase-3的表达与临床及病理学特征的关系(例) 单位：例

续表3

2.3 c-IAP1和Caspase-3蛋白在喉癌组织中表达的Spearman等级相关分析 在60例喉鳞状细胞癌中，c-IAP1和Caspase-3蛋白同时阳性表达5例，同时阴性表达4例；c-IAP1蛋白在喉癌组织的阳性表达与Caspase-3蛋白在喉癌组织的阳性表达呈负相关(P<0.001)，见表4。

表4 喉癌组织中c-IAP1与Caspase-3的组间等级相关性分析 单位：例

3.讨论

细胞凋亡是由基因控制的细胞死亡，对多细胞生物体的发育和动态平衡至关重要。细胞死亡过多和不足都会导致异常或疾病。参与凋亡的分子机制在不同物种间高度保守。Caspase是诱导细胞凋亡的关键介导因子，是一类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，它将底物切割在天冬氨酸残基的羧基侧。目前已知至少有14种不同的Caspase存在[4]，其中2/3在细胞凋亡中起作用。参与细胞凋亡的Caspase可分为两大类，即启动子Caspases和下游效应Caspases。其中Caspase-3是目前研究最广泛的效应因子，在细胞凋亡中发挥着重要的调控作用。

凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员在细胞凋亡、细胞死亡、细胞信号传递、细胞迁移和有丝分裂等方面也发挥了重要作用[5]。该家族由8种蛋白组成(阿波罗龙、c-IAP1、c-IAP2、ILP-2、Livin、Naip、Survivin、XIAP)，它们在细胞死亡的负调控中起着关键作用。所有IAP都有一个共同的结构特征：它们显示一个或多个杆状病毒IAP重复结构域，直接负责这些蛋白质的抗凋亡功能。已有令人信服的证据表明，c-IAP1通过与caspase-3结合抑制细胞死亡，并废除了它们的促凋亡功能。

从Varfolomeev Eugene等[6]的报道中可知c-IAP1是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导NF-κB活化的关键介导因子，在肿瘤的发生发展中有重要推动作用。许多研究中已经证实c-IAP1在肝癌[7]、膀胱癌[8]、宫颈癌[9]、胃癌[10]等多种肿瘤组织中发挥了重要作用，但是c-IAP1在头颈部肿瘤中的表达及预后报道尚少。本研究收集了手术切除且病理学诊断为喉鳞状细胞癌的60例石蜡切片，对应癌旁正常上皮组织60例，通过免疫组化检测c-IAP1蛋白在喉癌组织中表达阳性率为81.67%，明显高于癌旁正常上皮组织(χ2=42，P<0.001)，结合患者临床病理特征发现，c-IAP1蛋白表达水平与吸烟、饮酒、分化程度、淋巴结转移、TNM分期具有相关性，而与年龄、性别、临床分型无相关性。喉癌组织中caspase-3蛋白的阳性率仅为20.00%，低于其在正常癌旁组织中的阳性率(χ2=42.087，P<0.001)。在Wang Y等[11]的研究中可发现caspase-3的表达率在胃黏膜癌变进展中呈下降趋势。Sarah J.Storr等[12]发现Caspase-3在乳腺癌组织中的表达明显低于正常乳腺组织。Jayathilake AG等[13]研究发现Caspase-3的表达在腺癌细胞中明显低于正常细胞，表达水平与腺癌的恶性程度呈负相关，进一步证实了其在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。此外，许多文献也已经证实了Caspase-3在胃癌[14]、宫颈癌[15]、皮肤恶性肿瘤[16]、前列腺癌[17]等疾病中也呈现低表达，发挥调控作用。结合本实验患者临床病理特征发现，caspase3蛋白表达水平与吸烟、饮酒、分化程度、淋巴结转移、TNM分期具有相关性，而与年龄、性别、临床分型无相关性。

综上所述，本研究初步发现c-IAP1蛋白在喉癌组织中呈高表达，而在其对应癌旁正常组织中呈现低表达；caspase3蛋白在喉癌组织中呈低表达，而在其对应癌旁正常组织中呈现高表达；c-IAP1蛋白与caspase3蛋白在喉癌组织中的表达呈负相关；c-IAP1蛋白和caspase3蛋白与吸烟、饮酒、分化程度、淋巴结转移、TNM分期具有相关性，而与年龄、性别、临床分型无相关性，进一步证实上述两种蛋白在喉鳞状细胞癌的浸润和转移中发挥着重要作用。喉癌的发生发展是需要多因素共同作用的，是一个多阶段的发展过程，c-IAPl和Caspase-3蛋白在喉癌发生发展中的重要作用有可能成为喉癌治疗的新靶点，从而提高喉癌治疗效果，改善患者生存质量。因此，进一步深入研究c-IAP1和caspase3蛋白在喉鳞状细胞癌发生、发展中的机制，调控两种蛋白的表达，从而抑制喉鳞状细胞癌的发生和发展，可为喉鳞状细胞癌患者的生物靶向治疗提供一个初步的理论依据。