“钩藤-黄芩”药对治疗癫痫的潜在作用机制探讨*

周娇娇，张青萍，吴成挺，李果，何业辉，吴鹏

1 广西中医药大学 广西南宁 530200

2 广西中医药大学第一附属医院 广西南宁 530023

癫痫的发作与脑神经元的异常过度放电有关，是以突发性或暂时性的意识、感觉、运动、自主神经或精神行为异常为主要临床表现的中枢神经系统疾病[1-2]。流行病学显示，癫痫的全球患病率为 7.6‰，其中10%～20%的患者停药后容易复发[3]。目前临床应用丙戊酸钠、苯妥英钠、卡马西平等西药抗癫痫治疗，这些药物治疗癫痫的临床疗效虽然得到了肯定，但却存在着共济失调、眩晕头痛、过敏等不良反应，部分患者常常因不能耐受而中断治疗[4]。因此迫切需要副作用更小，疗效更稳定的新药来进一步补充。中药治疗癫痫具有疗效好、副作用小，整体辨证施治的特点，可在一定程度上弥补西医治疗的不足，得到越来越多学者的认可[5]。

癫痫属于中医“痫病”“痫证”“癫疾”的范畴，与风、痰、热、瘀、毒等病理因素密切相关[6-7]。《内经》有言“诸风掉眩皆属于肝，热盛动风，风胜则动”，《医方考》曰：“癫疾者，风痰之故也……风热盛于肝，则一身之筋牵掣，故令手足搐溺也”，均表明痫病的发病与肝热盛、肝阳亢密切相关。因此，临床上治疗痫病中医辨治注重“清肝泻火”[8-9]。“钩藤-黄芩”是导师治疗癫痫的常用药，临床疗效显著，钩藤首载于陶弘景《名医别录》，其味甘，性凉，“入足厥阴肝经，泻湿清风，止惊安悸”，既清肝热，平肝阳，又能息风定惊止痉。黄芩始载于《神农本草经》，其味苦，性寒，主入少阳经 ，善清中上焦湿热，具有清热燥湿、泻火解毒之功。钩藤、黄芩相使为用，黄芩可增强钩藤清肝热平肝阳之功效，大大提高了治疗肝火痰热癫痫的临床效果。现代药理研究显示，钩藤具有神经保护、镇静催眠、抗惊厥癫痫、保护心肌、降压、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等药理作用[10-11]。黄芩既可抗惊厥、保护神经，亦可抗癫痫[12]，其中黄芩有效成分黄芩苷保护神经元、抗癫痫作用已在试验观察中得到证实[13-15]，但目前尚没有确切的证据表明“钩藤-黄芩”两者合用能有效地改善癫痫的症状，所以发现治疗癫痫的关键活性成分及潜在作用机制尤为重要，以更好的应用于临床上治疗癫痫病。

网络药理学是以“药物-有效成分-基因-疾病”为关系网，从系统生物学与生物网络平衡的角度剖析中药治疗疾病的作用靶点，从而预测出药物的潜在作用机制的一种新兴研究方法[16]。本研究基于网络药理学方法来剖析“钩藤-黄芩”治疗癫痫的潜在作用机制，以期于临床上对癫痫的治疗提供相关的参考。

钩藤和黄芩有效成分筛选

本研究运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform），分 别以“钩藤”和“黄芩”为关键词，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物类药性（drug likeness，DL）≥0.18为筛选条件，检索其有效活性成分。

1 钩藤和黄芩作用靶点筛选

通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）查询其活性成分所对应的靶点基因，将靶点名称标准化，整理后去除重复值，获得最终中药作用靶点。

2 癫痫相关靶点筛选

以“epilepsy”为 检 索 词，运 用OMIM 、CTD、DisGeNET等数据库搜索癫痫疾病靶点，导出结果，整合各个数据库获得的疾病靶点，利用Excel去除重复项得到癫痫相关靶点数据。

3 获取“钩藤-黄芩”靶点与癫痫靶点的交集

借助Venny2.1在线软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），把“钩藤-黄芩”作用靶点与癫痫靶点取交集，得到“钩藤-黄芩”治疗癫痫的关键靶点，即中药-疾病共同靶点，并绘制韦恩图（见图1）。

4 中药-有效成分-靶基因-疾病调控网络的构建

运用Cytoscape3.8.2软件绘制并构建中药-有效成分-靶基因-疾病调控关系网络（见图2），将1.1获得的“钩藤-黄芩”有效活性成分和1.4获得的“钩藤-黄芩”与癫痫交集靶点进行关联及拓扑学参数分析。

5 PPI网络的构建与核心基因的筛选

将药物-疾病交集靶点导入string11.0在线软 件（https://string-db.org/），在“Organism”中 选 择“homo sapiens”，保存string_interactions.tsv文件，运用Cytoscope3.8.2软件对该文件节点分析排序处理（见图3）。再运用R软件中的count.R对该文件进行运算，最终得出PPI网络核心基因条形图（见图4）。

6 中药-疾病靶点GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

下载clusterProfilerGO.R功能包将1.4中药-疾病交集靶点进行运算分析，得到GO功能富集分析（见图5）和KEGG通路富集分析（见图6），以P≦0.05为差异有统计学意义，取前20的结果。

结 果

1 钩藤有效成分和靶点预测结果

在TCMSP数据库中检索到主要有效成分钩藤33个，黄芩36个，去除重复项后，共获得66个目标成分，检索得到对应的钩藤相关靶点1074个，黄芩相关靶点1203个，去除重复项后得到钩藤对应靶点103个，黄芩对应靶点53个，合计“钩藤-黄芩”作用靶点156个，去除重复项113个。

2 中药-疾病靶点构建结果

图1韦恩图表明中药-疾病公共靶点即交集靶点46个。其中癫痫疾病相关靶点1716个，“钩藤-黄芩”靶点113个。

图1 中药-疾病靶点

3 中药-有效成分-靶基因-疾病调控网络的构建结果

运用Cytoscape3.8.2软件构建的中药-有效成分-靶基因-疾病关系网络图（见图2），发现“钩藤-黄芩”主要通过66种有效活性成分作用于46个靶点，这46个靶点基因可能对癫痫的发生发展产生影响。其中红色六边形代表癫痫（癫痫），蓝色、黄色八边形分别代表钩藤、黄芩，紫色椭圆形代表钩藤-黄芩的有效成分，绿色菱形代表“钩藤-黄芩”与癫痫的共同靶点基因。

图2 中药-有效成分-靶基因-疾病关系网络图

4 PPI网络构建结果

由图3、图4可知，利用Cytoscape3.8.2软件，根据Degree值对46个靶点进行有序排列，排在前5的靶点依次为IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS，所以IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS最有可能成为核心靶点基因。

图3 PPI网络图

图4 PPI网络核心基因条形图

5 GO功能富集分析

最终得到107条GO生物学过程，均符合P≤0.05，“钩藤-黄芩”治疗癫痫的核心靶点GO功能富集分析见图5（选取具有代表性的前20条），可知“钩藤-黄芩”治疗癫痫的核心靶点的GO功能主要包括DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、突触后神经递质受体活性、药物结合、神经递质受体活性、血红素结合、四吡咯结合、氧化还原酶活性、泛素蛋白连接酶结合、肽结合等。

图5 GO功能富集分析柱状图

6 KEGG通路富集分析

共获得106条KEGG信号通路，P均≦0.05，“钩藤-黄芩”治疗癫痫的KEGG通路富集分析结果见图6，并构建通路-靶点关系网络图（取前30条，见图7）。说明“钩藤-黄芩”可能通过作用于脂质与动脉粥样硬化信号通路、化学致癌-受体激活信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等治疗癫痫。

图6 KEGG通路富集分析气泡图

图7 通路-靶点关系网络图

讨 论

1 潜在有效成分

本研究预测“钩藤-黄芩”作用于癫痫的主要成分包括Rhynchophylline（钩藤碱）、Baicalein（黄芩素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和 quercetin（槲皮素）。其中发挥抗癫痫作用的有效成分主要为钩藤碱，其抗痫机制可能与氧化应激、免疫应答、神经递质受体相关[10]。研究发现钩藤碱不仅可减少内侧内嗅皮质（mEC）Ⅲ层神经元凋亡，使mECⅡ层神经元的自发性癫痫样放电终止，还可以通过抑制持续钠电流和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体电流来抑制神经细胞的过度兴奋，从而有效降低大鼠动物模型癫痫发作程度[17]。黄芩素不仅可通过抗氧化应激、抗炎、抗神经细胞毒性和抑制神经元凋亡等分子机制对神经细胞起保护作用[18-20]，还可以抗癫痈并改善大脑认知功能，Xu Qian[21]等通过研究进一步证明黄芩素通过抑制氧化应激、抑制炎症反应、调节糖皮质激素等多种途径，从而减少癫痫大鼠海马损害，改善大鼠认知功能。β-谷甾醇可通过多靶点、多途径发挥其抗炎、抗氧化、神经细胞保护作用[22]，董雪等[23]研究证实了β-谷甾醇不仅对海马神经元无毒性，还可以保护神经元并用于癫痫的治疗。BDNF是脑源性神经营养因子之一，主要参与神经细胞分化，神经递质合成及海马的兴奋性，癫痫发生时BDNF表达增加，槲皮素可干预并降低癫痫大鼠海马区BDNF mRNA的上调，发挥其抗癫痫作用[24]。

2 关键基因靶点

本研究预测白细胞介素6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、表皮生长因子受体（EGFR）、Fos等是“钩藤-黄芩”治疗癫痫的潜在基因靶点，其中EGFR、Fos与癫痫关系目前研究较少，IL-6、VEGFA、CASP3等相关靶点基因与癫痫的发生更为密切，IL-6是一种多效性的低分子量炎症因子，为炎症相关通路的上游介质，是体内炎症反应的重要且敏感的标志物[25]。而癫痫发作的机制与炎症密切相关，在某些特殊类型的癫痫综合征（如Rasmussen综合征）中，IL-6指标显著上升[26-27]。诸多研究表明炎症因子IL-6在癫痫起源区域以及播散区域的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞中过度表达，同时该区域炎性因子的受体蛋白上调，并通过细胞的自分泌或者旁分泌系统启动相关的细胞信号传导通路，进而导致癫痫的发作[28]。由此可见，炎症因素是癫痫反复、长期发作的重要机制之一，因此通过检测患者血清IL-6水平可很好的了解患者癫痫发作的炎性反应情况。VEGF主要由神经细胞、神经胶质细胞及炎症细胞产生，具有增加血管通透性，促进内皮细胞增殖和血管生成以及保护神经组织等作用，大量研究表明，VEGF可直接作用于神经细胞，参与癫痫等神经系统疾病的病理过程[29]。癫痫发作后神经元和神经胶质细胞内的VEGF表达上调，可拮抗癫痫发作所导致的神经退化。另外，癫痫发作后可出现脑内血氧不足的情况，缺氧则易导致神经细胞受损，而VEGF能抗细胞凋亡[30]。Caspase家族在细胞凋亡的蛋白酶系统中发挥重要作用，其中Caspase-3的激活是神经细胞凋亡的标志。在癫痫病中，随着神经元的凋亡，Caspase-3表达增加，丁春晓等[31]通过实验研究进一步验证了Caspase-3参与癫痫所致的神经元凋亡的过程。

3 KEGG分析

利用R语言预测 KEGG 通路，发现“钩藤-黄芩”主要可能通过PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路等途径发挥对癫痫的作用。

PI3K-Akt、TNF、IL-17、AGE-RAGE四条信号通路主要参与炎症反应及细胞增殖与凋亡。PI3K-Akt信号通路是一条经典的抑制细胞凋亡与促进细胞存活的信号转导途径，PI3K为上游信号，可以激活并促使其下游AKT磷酸化的发生，并参与信号转导的整个过程，促使细胞自噬凋亡、能量代谢与炎症反应的发生。PI3K-Akt信号通路与炎症反应呈负相关，激活PI3K/AKT信号通路可以在一定程度上抑制炎症通路的激活及相关炎症因子的释放，从而减轻对神经细胞的损伤[32]。PI3K-Akt通路的激活在缺血缺氧性神经元损伤中起着重要作用，若在癫痫发作干预该信号通路，可以降低细胞凋亡的发生而减轻脑损伤[33-35]。李萍等[36]研究发现，PI3K/AKT信号通路与海马组织细胞的凋亡密切相关，激活PI3K/AKT通路可抑制其下游凋亡信号通路的表达，进而抑制海马区神经元的凋亡。TNF信号传导通路的激活，可促进细胞生长、分化及凋亡，同时TNF在参与炎症反应的调控过程能够引起炎性病理损害，进而直接或间接的导致脑组织损伤[37]，TNF还能介导PI3K-Akt信号通路的激活，从而参与细胞凋亡的过程[38]。IL-17信号通路也同样起介导炎症反应和促进细胞凋亡的作用[39]，M.Lv通过动物实验研究发现，在缺血再灌注损伤的大鼠大脑皮层中，在星形胶质细胞中释放的IL-17可加速神经元的死亡，下调IL-17的生成可明显使神经元的凋亡减少[40]。Mao等[41]观察到IL-17在癫痫患者的脑脊液及血清中明显增加，并且与癫痫发作强度呈正相关。已有研究证实RAGE也可干预一系列炎症信号，同时RAGE也参与癫痫发作的炎症反应[42]。由以上四条信号通路推测“钩藤-黄芩”的有效成分可以通过调控炎症反应及降低神经细胞凋亡以达到治疗癫痫的作用。

在癫痫发作导致的脑损伤中，可出现脑缺血缺氧反应，而HIF-1信号通路在癫痫发作中可被启动，并且在组织缺氧状态下的表达增加以抑制缺氧状态下神经干细胞的分化[43]。由此推测，“钩藤-黄芩”还可能通过调节神经细胞在缺氧状态下的适应性来治疗癫痫。

结 语

综上，本研究推测出“钩藤-黄芩”可通过钩藤碱、黄芩素、β-谷甾醇、槲皮素等66个有效活性成分调控IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS等46个癫痫病的疾病靶点，影响炎症应答、凋亡过程的负调控等相关生物学过程及PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路等相关信号通路，从而发挥治疗癫痫的作用，为后续深入研究“钩藤-黄芩”治疗癫痫提供了理论依据，为“钩藤-黄芩”药物的开发利用提供新思路，但仍需进一步加强试验研究及验证，为更深层次的充分挖掘奠定基础。