一例猪链球菌与猪圆环病毒3 型混合感染的诊治

蔡卫忠，吴早林，全 涛，杨克礼，田永祥

（1.红安县农业农村局，湖北红安 438499；2.鹤峰县农业农村局，湖北鹤峰 445800；3.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，武汉 430064）

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是重要的人畜共患病原，链球菌感染可引起脑膜炎、心肌炎和败血症等症状。猪链球菌病是由链球菌引起的猪急性、败血症型和脑膜炎型的人畜共患传染病［1］，该病在世界范围内广泛存在，给养殖业造成了严重的经济损失，同时给相关从业人员的生命安全造成了严重的威胁［2］。猪链球菌据其荚膜多糖的差异，有35 个血清型，引起猪和人发病的以2 型猪链球菌为主［3，4］。临床上有急性和慢性两种病例。急性一般未出现症状即死亡，主要是败血症；慢性主要表现为关节肿大、跛行，耳后、腹下、肛门等有出血点等。急性型发病率和死亡率均较高；慢性型死亡率较低，但影响感染猪的生长发育［4］。

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）在分类学上属圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovi⁃rus）［5］。2016 年以前，在全球范围内仅发现猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）有PCV1 和PCV2 两个基因型［6］。PCV1 对猪无致病性。PCV2 感染后主要危害是引起猪体的免疫抑制，导致继发其他疫病从而造成死亡［7］。2016 年，美国报道发现一种新的圆环病毒-猪圆环病毒3 型（Porcine circovirus type 3，PCV3），随后韩国、波兰、意大利和中国等国均报道有PCV3 的 发 生［8，9］。PCV3 感 染 猪 的 临 床 表 现 与PCV2 相似。临床上，PCV3 可单独存在，也可与其他病原混合感染［10］。

2021 年10 月份，湖北省红安县某规模化猪场保育猪先后大量发病，出现持续性、反复性腹泻、发烧、气喘等症状，四肢前端、后背、臀部皮肤发绀，后背两侧皮肤有散在红色点状丘疹，持续近20 d，病猪消瘦，部分猪只死亡，经济损失较大。将猪场送检的病料送至相关实验室进行病原分离鉴定和PCR 检测，诊断为猪链球菌和PCV3 混合感染。根据临床及实验室诊断结果，制定了综合防控技术方案，经实施后，疫情得到了有效控制。将该病的防控工作总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料

发病濒临死亡保育猪2 头，由湖北省红安县某规模化猪场送至相关实验室进行检测。

1.2 试剂

Viral DNA/RNA Miniprep Kit（Axygen Scientif⁃ic），Ex-Taq 酶、Prime Script One Step RT-PCR Kit、DL 2000 Marker（Takara），M-肉汤培养基、营养琼脂培养基、鲜血培养基以及其他生化培养基均购自青岛海博生物技术有限公司；其他生化试剂为国产分析纯，购自商业公司。PCV3 检测引物由北京擎科生物工程公司合成。

1.3 样品处理

无菌采集病料组织直接涂布载玻片，进行革兰氏染色；无菌采集病猪肺、脾及淋巴结等组织，制作抹片，经干燥、火焰固定后进行革兰氏染色，在显微镜下观察其形态特征。

1.4 细菌分离培养

于超净工作台中用接种环取前述病料直接接种于鲜血琼脂平板，置37 ℃培养箱中培养24~48 h 后，挑取典型菌落接种于琼脂斜面培养基，置37 ℃培养24~48 h，革兰氏染色、镜检，并做进一步的生化试验。

1.5 病毒核酸的提取

将病料组织与DMEM 溶液按体积比1∶5 混合，充分匀浆，反复冻融3~5 次，立即提取核酸或置于-80 ℃保存备用。病毒核酸按病毒DNA/RNA 提取试剂盒说明书进行提取。

1.6 PCV3 PCR 扩增

取提取的DNA，利用文献［11］中的引物对其进行PCR 扩增。PCR 反应体系总体积为50 μL，包含10 × PCR buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 上下游引物各1 μL，Ex-Taq（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 5.0 μL，ddH2O 补充至50 μL。循环参数为94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃1 min，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并在凝胶成像系统中观察，拍照记录结果。

1.7 防控措施

加强管理，全面消毒。严禁生产区工作人员出入，饲养员和各类用具严禁串舍。舍外场地和猪舍空栏用2%~3%的氢氧化钠（烧碱）溶液喷洒消毒。猪舍内每3 d 用消毒水带猪消毒1 次。

紧急接种。对无明显症状的猪只，用自家苗紧急免疫，2~4 mL/头。

对症治疗。对继发感染的猪只，根据药敏试验结果，应用高敏抗菌药物进行治疗；对呼吸困难的猪只使用麻黄碱、氨茶碱等止咳平喘药物进行治疗；对发热猪只使用安乃近、氨基比林等退烧药物进行治疗。

辅助治疗。PCV3 为病毒性疫病，使用抗生素治疗无效，建议配合使用干扰素、免疫球蛋白、病毒灵、高免血清等广谱抗病毒的药物进行辅助治疗。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养和鉴定结果

病料组织接种鲜血琼脂平板，经37 ℃培养24 h后，可见灰白色、稍微隆起的、表面光滑湿润的半透明的小菌落，菌落周围可见约1 mm 透明溶血环，呈典型的β-型溶血（图1）。革兰氏染色，镜检可见大量短链状或长链状排列的革兰氏阳性球菌（图2）。对分离纯化的细菌进行生化试验，结果该菌发酵麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖、水杨酸和山梨醇，不发酵阿拉伯糖和木糖，综上判定该菌为链球菌。

图1 鲜血琼脂平板上的菌落

图2 显微镜下的革兰氏阳性链球菌

2.2 PCV3 PCR 检测结果

以病猪组织中提取的病毒DNA 为模板，利用文献中［11］PCV3 特异性引物进行PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果所检测的组织样品全部扩增出与预期产物大小相一致的目的条带（约1 021 bp），即为PCV3 阳性（图3）。

图3 PCV3 PCR 扩增产物电泳

综合检测结果可知，所检8 份组织样品均为猪圆环病毒3 型阳性，结合临床表现及细菌分离培养结果，判定该猪场本次暴发的疫情为猪链球菌和猪圆环病毒3 型的混合感染。

按“1.7”综合防控措施实施14 d 后，该猪场的发病猪头数日益减少，猪场已无死亡病例发生，疫病得到控制。30 d 后疫情平息，生产恢复正常。

3 讨论

根据临床症状、剖检病理变化及细菌分离培养结果，结合实验室分子生物学检测结果，8 份组织样品PCV3 均为阳性，确诊该猪场发生的疫病为猪链球菌与PCV3 的混合感染。猪链球菌病一年四季均有发生，饲料营养失衡、饲养环境差、应激等因素均可诱发该病［12］。但在很多情况下，链球菌可继发于其他病原感染之后，如PRRSV 感染、PCV2 感染等。

自2017 年以来，中国包括湖北省、山东省及广东 省 等10 多 个 省 份 均 发 现 有PCV3 的 存 在［13，14］。PCV3 初次发现时，感染PCV3 的猪并无特征性临床特征呈现，仅是组织切片中部分组织出现了病理变化［8］。但这些病理变化不一定是猪感染PCV3 后引起的特征性病变。目前由于PCV3 无有效药物进行治疗，同时PCV3 分离培养难度相对较大，再加上PCV3 的病原学特性、流行病学特点、致病机理等尚不完全清楚，因此PCV3 的预防和控制更加不易。

混合感染常常使猪病情复杂化，给疾病的诊断、治疗增加了难度，因此对发病猪尽早确诊、尽早治疗，以减少混合感染、继发感染病例的发生。各类养猪场，对于疫病的防控均应贯彻预防为主的方针，加强饲养管理，搞好环境卫生。猪舍保持良好的通风和适宜的温湿度；给予猪只充足的营养，减少应激；定期消毒，交替使用消毒药，防止耐药菌株的产生。只有采取上述综合防控措施才能最大限度地减少疫病的发生，确保养殖场健康可持续发展。