遮光诱导的氧化应激对蛋鸡卵泡发育的影响

李先强，王家乡，吴艳，程诗彬，皮劲松，伍志敏，张颖，刘艳芳，朱昌友

（1.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434023；2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉 430064；3.武汉民族科技饲料有限公司，湖北武汉 430223；4.湖北省科技信息研究院，湖北武汉 430071；5.湖北省畜牧良种场，湖北荆州 434010）

光照是密闭家禽舍中必不可少的环境因素之一。光线不仅为家禽提供照明，还影响家禽的生理反应、行为、生长发育和生产性能。家禽对光线感知尤其敏感，光线可对家禽生长和繁殖产生重大影响。家禽缺乏光照时会产生氧化应激，促进颗粒细胞凋亡、自噬及卵母细胞损伤，从而影响卵泡发育。也有研究表明，光照可以通过影响家禽体内卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、促性腺激素释放激素（GnRH）等繁殖激素的水平变化来影响蛋鸡卵泡发育。光照还可以促进仔鸡能量摄入，较高的能量摄入促进下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴激活，增加了体内脂质沉积，并且刺激生殖激素水平，从而全面加速仔鸡的性成熟。此外，光照还可以通过促进褪黑素分泌来减轻家禽氧化应激，间接影响卵泡发育。卵泡发育的状态直接影响家禽的等级卵泡和排卵卵泡数量，从而对家禽产蛋数量产生相应的影响。迄今为止，尚无关于遮光引起的氧化应激对鸡卵巢功能和卵泡发育的影响的相关报道。因此，本文研究了遮光引起的氧化应激对蛋鸡卵泡发育的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计 将30 只体重约1.8 kg 且产蛋率相近（约为80%）的40 周龄健康产蛋鸡（随机分为遮光组、正常光照组和遮光+复合维生素组，每组10 只，蛋鸡由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提供。在室温下，将每只母鸡放在笼子里，喂养基本饮食，自由进食和喝水。遮光组使用遮光布覆盖鸡笼，以将鸡笼内的光强度降低至零，而不会影响通风和食物摄入。正常光照组未做其他处理，其光照程序为16 h 光照:8 h 黑暗。遮光+复合维生素组除了用遮光布覆盖外，还在饲料中添加200 mg/kg 的复合维生素并将其混匀。复合维生素由珠海市维诺种养有限公司提供。

1.2 样品采集 处理7 d 后，遮光组产蛋鸡的采食量显著降低，平均产蛋率由80% 降至28%，但遮光+复合维生素组产蛋鸡的采食量和产蛋量无显著变化。每组随机抽取5 只蛋鸡进行采血，室温静置30 min 后，血清自然析出，分离血清并保存在4℃。之后立即脱颈处死蛋鸡，解剖并采集卵泡，收集卵巢和肝脏组织。

1.3 颗粒细胞的分离和培养 收集3 组鸡的小黄卵泡，并将其置于冰冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中。用无菌眼科镊子除去卵泡的外血管和结缔组织，将卵泡切开并迅速挤压以排出蛋黄。用镊子在PBS 中轻轻摇动卵泡，以分离颗粒细胞层。将与粒状细胞层混合的液体转移至50 mL 离心管中，加入5 mL 提前溶解的 0.1% II 型胶原酶，并将样品在37℃振荡孵育30 min 以进行消化。终止消化时，添加5 mL 含10% FBS 的M199 培养基，将样品轻轻吸移10～20 次，并用200 目细胞筛过滤，用M199培养基冲洗滤网，并将其以1 000 r/min 离心10 min。弃去上清液，收集细胞沉淀并用培养液洗涤2 次。将细胞沉淀重悬于完全培养基（1%青霉素-链霉素溶液+10%胎牛血清+M199 培养基）中。将细胞悬浮液在完全培养溶液中稀释至1×106 细胞/mL 浓度。将悬浮的颗粒细胞加到细胞培养皿中，放置于37℃细胞培养箱中。

1.4 CCK-8（细胞计数试剂盒8）检测颗粒细胞增殖活性 将分离的和培养的颗粒细胞组铺在6 孔细胞板上，并分别在细胞贴壁24、48、72、96 h 后，加入CCK-8试剂，于培养箱中孵育1 h，测量450 nm 处的吸光度。

1.5 蛋鸡氧化应激指标的检测 采用ELISA 试剂盒（合肥莱尔生物技术有限公司，2020）测量血清、肝脏组织、卵巢组织和颗粒细胞中FSH、LH、孕酮（P）、活性氧（ROS）含量、丙二醛（MDA）水平和总抗氧化（T-AOC）水平，以及抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）活性。还通过ELISA试剂盒检测了血清、肝脏组织、卵巢组织和颗粒细胞中的DNA 氧化损伤（8-OHdG）。

1.6 蛋鸡卵巢组织和颗粒细胞Q-PCR 分析 使用Trizol 从卵巢组织和颗粒细胞中提取RNA，然后进行反转录（TaKaRa，中国大连）合成总cDNA，使用荧光定量试剂盒（TOYOBO，日本大阪），50 µL 反应体系：1×SYBRGreen Realtime PCR Master Mix 25 µL、Upstream primer（10 µmol/L）5 µL、Downstream primer（10 µmol/L）5 µL、cDNA template 5 µL、ddHO 5 µL。表1 反应程序进行Q-PCR，分析氧化应激相关基因和的表达水平。

表1 Q-PCR 反应程序

1.7 统计分析 试验数据采用 SPSS 26.0 软件的单因素方差分析，Duncan's 法进行多重比较，利用GraphPad Prism 5 进行作图，显著性差异以<0.05 表示，结果表示为平均数±标准误。

2 实验结果

2.1 遮光处理后蛋鸡颗粒细胞增殖活性的检测 CCK-8试验结果表明（图1），遮光组24、48、72 h 和96 h的相对增殖活性分别为1.293、1.479、1.093 和0.813，遮光+复合维生素组分别为1.652、2.029、1.582 和0.866，对照组均为1。与对照组相比，遮光组和遮光+复合维生素组的颗粒细胞增殖均从0～48 h 开始增加，而在48～96 h 后则明显减少。此外，遮光+复合维生素组的颗粒细胞增殖活性始终高于遮光组。这表明遮光处理时，颗粒细胞的增殖活性下降。

图1 遮光处理对卵泡中颗粒细胞增殖活性的影响

2.2 遮光处理后蛋鸡氧化应激指标检测的变化

2.2.1 遮光处理后蛋鸡体内激素含量的变化 由表2 可知，遮光处理7 d 后，遮光组蛋鸡的血清（<0.01）、肝脏和颗粒细胞（<0.05）中FSH 水平低于正常光照组，遮光组蛋鸡血清、肝脏和颗粒细胞中FSH 水平低于遮光+复合维生素组（<0.01），正常光照组和遮光+复合维生素组间无显着差异。遮光组血清（<0.05）、卵巢（<0.01）和颗粒细胞（<0.05）的LH 水平低于正常光照组，遮光组血清（<0.05）、肝脏和卵巢（<0.01）的LH 水平低于遮光+复合维生素组，正常光照组和遮光+复合维生素组间无显著差异。遮光+复合维生素组卵巢组织中的LH 水平高于正常光照组（<0.05）。遮光组血清、肝脏（<0.01）和颗粒细胞（<0.05）中P水平高于正常光照组，遮光组血清（<0.01）、肝脏、卵巢和颗粒细胞（<0.05）中P水平高于遮光+复合维生素组，正常光照组和遮光+复合维生素组没有显著差异。

表2 遮光对蛋鸡血清、肝脏、卵巢组织和颗粒细胞中激素水平的影响

2.2.2 遮光处理后蛋鸡体内抗氧化系统的变化 由表3可知，遮光处理7 d 后，遮光组血清、肝脏和颗粒细胞的ROS 水平高于正常光照组和遮光+复合维生素组（<0.05），后2 组无显著差异。遮光组蛋鸡血清和颗粒细胞的MDA 水平高于正常光照组和遮光+复合维生素组（<0.05），遮光组卵巢组织MDA 水平高于正常光照组（<0.05）。正常光照组和遮光+复合维生素组的MDA 水平无显著差异。遮光组血清、肝脏和颗粒细胞的T-AOC 水平高于正常光照组和遮光+复合维生素组（<0.05）。遮光组卵巢组织中的T-AOC 水平高于遮光+复合维生素组（<0.05）。正常光照组和遮光+复合维生素组的血清和卵巢组织中的T-AOC 水平无显著差异。遮光+复合维生素组肝脏和颗粒细胞中的T-AOC 水平高于正常光照组（<0.05）。遮光组卵巢组织和颗粒细胞的SOD 水平高于正常光照组和遮光+复合维生素组（<0.05）。遮光组血清SOD 水平高于遮光+复合维生素组（<0.05）。正常光照组与遮光+复合维生素组的SOD 水平无显著差异。遮光组血清、肝脏和颗粒细胞的GSH 水平高于正常光照组和遮光+复合维生素组（<0.05）。正常光照组肝脏的GSH 水平高于遮光+复合维生素组（<0.05）。正常光照组和遮光+复合维生素组的血清、卵巢组织和卵泡颗粒细胞GSH 水平无显著性差异。遮光组肝脏、卵巢组织和颗粒细胞的CAT 水平高于正常光照组和遮光+复合维生素组（<0.05），遮光组血清CAT 水平高于遮光+复合维生素组（<0.05）。遮光组的血清、肝脏、卵巢组织和颗粒细胞中的8-OHdG 水平高于正常光照组和遮光+复合维生素组（<0.05）。正常光照组和遮光+复合维生素组的血清、肝脏和卵巢组织中的8-OHdG 水平无显著差异。遮光+复合维生素组卵泡颗粒细胞中的8-OHdG 水平高于正常光照组（<0.05）。

表3 遮光对蛋鸡血清、肝脏、卵巢组织和颗粒细胞中的抗氧化指标的影响

2.3 遮光处理后蛋鸡氧化应激相关基因表达水平的变化 由表4 可知，遮光处理7 d 后，与正常光照组相比，卵巢组织中遮光组的抗凋亡基因的表达水平降低（<0.01），抗氧化酶（<0.05）、、促凋亡（<0.01）基因表达水平升高；遮光组抗氧化酶（<0.05）、和促凋亡（<0.01）基因表达水平高于遮光+复合维生素组；正常光照组和遮光+复合维生素组的和基因表达水平无显著差异。

表4 遮光处理对卵巢组织和颗粒细胞中相关基因表达水平的影响

遮光处理7 d 后，在颗粒细胞中遮光组抗表达水平低于其他2 组（<0.01），遮光组S和基因表达高于正常光照组和遮光+复合维生素组（<0.01），其他基因的表达差异均不显著。

3 讨 论

3.1 遮光处理对蛋鸡卵泡发育相关激素的影响 遮光的家禽会引起氧化应激，并伴随一系列激素水平的变化。遮光后，蛋鸡的FSH 和LH 含量显著降低，P含量显著升高。光照可通过影响HPG 轴而直接影响家禽的繁殖性能。在光照应激对雌性大鼠性激素水平和卵巢组织肿瘤坏死因子、干扰素蛋白表达的影响研究中，光照组大鼠血清雌二醇（E）水平显著低于对照组，FSH 和LH 水平显著高于对照组。不同波长的光照会对家禽的HPG 轴产生不同的影响，血浆E含量在绿色光照蛋鸡中升高，P水平则在红色和蓝色光照蛋鸡中升高。在光刺激作用下，GnRH 刺激垂体前叶释放促性腺激素（FSH 和LH），这反过来又触发性腺发育和类固醇激素的合成（大卵泡颗粒细胞中的P和小卵泡中的E）。卵泡发育离不开FSH 和LH，光照也可通过诱导氧化应激的发生而间接影响FSH 和LH 等激素分泌，在各种因素引起的氧化应激模型中均检测到FSH 和LH 水平的变化。高温诱导的氧化应激蛋鸡中FSH、LH、E显著升高。在研究氯化汞在蛋鸡卵巢中引起的氧化应激时，用27.240 mg/kg Hg 处理可显著降低蛋鸡卵巢中FSH 和LH 含量。在对哺乳动物的氧化应激研究中，也发现了FSH 和LH 的变化。如双酚-a 类似物（双酚-s）在小鼠卵巢组织中诱导了氧化应激，并降低了LH 和FSH 含量。奎宁诱导的氧化应激大鼠的血清FSH 和LH 浓度显著降低。在槲皮素对氯化镉致雌性Wistar大鼠子宫和卵巢氧化应激的影响研究中，检测到大鼠卵巢中FSH 和LH 含量显著降低。一线抗结核药物的使用会导致大鼠氧化应激，并显著降低大鼠卵巢中的FSH 和LH 浓度。这些研究表明，氧化应激会影响家禽中某些激素的分泌。遮光引起的氧化应激导致家禽卵泡数量减少，改变相关激素分泌，并抑制卵泡发育，最终导致母鸡产蛋减少。

3.2 遮光处理对蛋鸡抗氧化指标的影响 氧化应激的发生伴随着体内抗氧化酶活性的变化。本研究发现在遮光条件下7d 后，蛋鸡血清、肝脏、卵巢和卵泡颗粒细胞中的ROS、T-AOC、MDA、SOD、GSH、CAT 和其他物质含量均呈现上升水平，抗氧化基因和的表达也显著升高。蛋鸡发生氧化应激时，其体内产生大量ROS，紧接着其抗氧化系统发挥作用，总抗氧化能力T-AOC 及SOD、GSH、CAT 等活性升高，清除过量的ROS，氧化应激产物MDA 含量也升高。不同因素导致的氧化应激均会伴随着机体抗氧化系统的改变。如大肠杆菌病导致产蛋鸡体内产生氧化应激，其MDA 水平及SOD、GPX 活性均显著升高。在伤寒引起的氧化应激蛋鸡中，ROS、谷胱甘肽还原酶、GPX 和谷胱甘肽S-转移酶活性较高。在过量饲料氟对蛋鸡产蛋性能及抗氧化能力的影响研究中，饲料添加800 mg/kg 和1 000 mg/kg 氟的母鸡血清GPX 活性和MDA 含量均高于对照组。除蛋鸡外，氧化应激在哺乳动物中也会表现出一系列氧化指标的变化。邻苯二甲酸盐（DEHP）诱导的氧化应激通过显著增加MDA 浓度以及谷胱甘肽合成酶（GSS）和SOD 的表达来抑制小鼠卵泡发育。在研究三聚氰胺对小鼠卵巢的氧化应激时，发现三聚氰胺组的ROS、MDA、GPX 和SOD显著高于对照组。在除草剂（2，4-二氯苯氧基乙酸）诱导的氧化应激大鼠中，ROS 和MDA 含量以及GPX和CAT 活性显著增加。营养限制诱导的氧化应激母羊中SOD、CAT 和GPX 浓度显著增加。在研究左旋肉碱（LC）和氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）对糖尿病大鼠的抗氧化作用时，其卵巢组织中GSH、CAT、SOD 的活性和MDA 含量均显著增加。这些结果与本研究结果基本一致，细微的差异可能部分是由于不同刺激引起的氧化应激。

3.3 遮光处理对蛋鸡颗粒细胞凋亡的影响 遮光会引起蛋鸡发生氧化应激，这可能会通过影响颗粒细胞的凋亡而引起卵巢损伤。本研究观察到在遮光7 d 后，抗凋亡基因的表达水平显著下降，促凋亡基因表达显著提高。无论是遮光诱导的氧化应激，还是其他因素引起的氧化应激，都会导致蛋鸡颗粒细胞凋亡，卵泡发育受阻，从而降低其产蛋率。有研究表明，过量的镉可引起蛋鸡卵巢的氧化应激、颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。在镉致蛋鸡颗粒细胞氧化损伤和凋亡的研究中，镉主要通过促进基因表达和抑制表达来发挥其毒性作用。高温诱导的氧化应激蛋鸡卵泡颗粒细胞中水平显著升高，而水平显著降低。饲喂氧化玉米油的母鸡发生氧化应激，卵泡颗粒细胞中和表达显著降低，而和的表达则显著上升。在对哺乳动物氧化应激研究中，一些化学试剂诱导的氧化应激可检测到同样的结果。甘氨酸诱导的氧化应激小鼠卵巢中表达水平升高，表达水平下降。在壬基酚（NP）诱导的氧化应激大鼠中，NP 处理的大鼠卵巢颗粒细胞水平显著降低，水平显著增加。聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）诱导大鼠氧化应激，从而增加卵巢组织中的表达并降低的表达。在丙烯酰胺诱导的氧化应激小鼠卵巢中，表达显著增加，的表达则显著减少。以上研究结果与本文结果一致，表明氧化应激通过调控卵泡颗粒细胞中凋亡相关基因的表达，从而促进颗粒细胞的凋亡，导致卵泡闭锁。

4 结 论

禽类在光照缺失时，机体会产生大量ROS，诱导氧化应激的发生。一方面，遮光诱导的氧化应激通过影响HPG 轴中卵泡发育相关激素的合成与分泌，降低FSH、LH 分泌，增加P分泌，来调控卵泡发育。同时，氧化应激的发生伴随着DNA 氧化损伤和抗氧化系统的变化，如遮光后蛋鸡血清和颗粒细胞中SOD、GSH、CAT 等酶活性和T-AOC 均显著增强，肝脏中除SOD外均显著增强，卵巢中除GSH 外均显著增强。另一方面，氧化应激影响颗粒细胞中凋亡相关基因的表达水平的变化，即抑制和促进的表达，从而促进颗粒细胞凋亡和加速卵泡闭锁，进而引起卵巢功能障碍。在家禽生产中，合理调节光照和减轻光照应激是家禽健康发展所必需的。