生物法制备纳米硒的研究进展和应用前景

殷婷婷，李志慧，苏佳贺，吴世迪，徐红岩，贺 帅,2，刘 培,2，李相前,2

（1淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003；2江苏省益生制剂重点建设实验室，江苏 淮安 223003）

0 引言

研究发现，硒(selenium，Se)是人体必需的微量元素之一，与人们日常生活息息相关[1]。硒具有美容养颜、防癌抗辐射以及免疫调节等功能，可应用于动物补硒[2]、植物补硒[3]、药物开发[4]。硒摄入不足，易得克山病，硒摄入过量，导致硒中毒，均对人体健康有害[5]。因此，寻找一种低毒性的硒替代品满足人们的需要这一问题急需解决，研究发现，低毒性、高生物活性的纳米硒能满足人们的需要，因此如何制备纳米硒，引起人们的广泛关注。

硒的粒径大小对研究其性质非常重要，有机硒、无机硒和纳米硒的性质完全不同[6]。有机硒参与蛋白的合成，易被人体吸收利用[7]。无机硒毒性大，不适合人体吸收利用[8]。纳米硒，粒径小，易被人体吸收[9]。同时，研究表明，纳米硒颗粒分散度高，生物活性高，急性毒性低，人体可耐受性高，是目前最热门的新兴纳米领域，具有广阔的应用前景[10]。本研究综述了生物法制备纳米硒的进展以及常见的表征手段，并归纳了纳米产品的应用前景。

1 研究现状

本研究从纳米硒的特性和3种制备方法来论述国内外制备纳米硒的研究现状。纳米硒、无机硒和有机硒，都拥有硒的相关特性，但其特性因尺寸大小而不完全相同。3种制备纳米硒的方法中，生物法较物理法和化学法更优良，且绿色无污染，是目前国内外最热门的合成方式。

1.1 纳米硒的特性

自1997年张劲松等[11]合成了红色的单质硒，开辟了纳米应用的新领域。如何绿色高效制备纳米硒，一直是人们的研究热点。研究发现，硒的生物吸收利用率：纳米硒＞有机硒＞无机硒；在急性毒性(LD50)方面，纳米硒＞有机硒＞无机硒；生物活性，即清除羟自由基的效率，纳米硒的清除率为无机硒的5倍，是有机硒的2.5倍[12]。无机硒、有机硒和纳米硒的比较详见表1。总之，纳米硒尺寸越小，生物活性就越高，性能也越优越。

表1 无机硒、有机硒和纳米硒的比较

1.2 纳米硒的制备方法

因纳米硒的应用前景广阔，合成红色尺寸较小的纳米硒，是目前学者们的研究热点，目前，国内外文献中已报道的合成纳米硒方法，按合成方式可分为3大类：物理法、化学法和生物法。

1.2.1 物理法 物理法制备纳米硒，一般是氧化还原法，先使用还原剂（肼[13]、谷胱甘肽[14]、抗坏血酸[15]等）和硒盐（亚硒酸或亚硒酸钠等）反应制备成红色零价单质硒，然后利用物理方法（微波辐射、激光消融、紫外辐射或超声波等）处理制备纳米硒。物理法合成纳米硒，实验条件要求苛刻，合成代价昂贵，耗时长，不易实现。

1.2.2 化学法 化学法制备纳米硒，一般是采用还原剂（抗坏血酸[16]、谷胱甘肽[17]、亚硫酸钠[18]等）还原硒盐（亚硒酸钠或亚硒酸）合成纳米硒，在合成纳米硒阶段，加入表面活性剂[19]或稳定剂[20]，来保证合成的纳米硒颗粒的粒径在0 ～1000 nm纳米范围内，稳定存在且不易聚集。化学法[21]合成纳米硒，成本昂贵，不易实现，合成过程中添加的化学物质不利于人体吸收[22]，会对环境造成污染，不利于产品后期的开发应用[23]。

1.2.3 生物法 生物法制备纳米硒，是利用微生物生长发育过程产生的有效物质（代谢产物[24]、酶[25]等）还原硒盐（亚硒酸钠、亚硒酸等）合成红色纳米硒，或植物提取物（蛋白质[26]、黄酮[27]、维生素等）中的有效物质将亚硒酸钠还原成红色纳米硒，是目前研究制备纳米硒这一领域的热点。生物法合成的纳米硒，细胞活性高，尺寸小，粒径均匀，反应条件温和，稳定性强，对环境友好，目前已成为国内外制备纳米硒的新趋势。

本研究将详细论述生物法制备纳米硒，第一，生物法制备纳米硒，分为微生物合成纳米硒和植物提取物合成纳米硒；第二，目前国内外研究者使用生物法制备的纳米硒及常见表征方法；第三，纳米硒的应用研究。

2 生物法制备纳米硒

生物法制备纳米硒，主要分为微生物和植物2大类，微生物（细菌、真菌等）和硒盐（亚硒酸、亚硒酸钠等）反应制备纳米硒。植物则主要是树叶提取物、果实提取物、根茎提取物等植物成分和硒盐（亚硒酸、亚硒酸钠等）反应制备纳米硒。微生物和植物提取物合成纳米硒的过程中，操作简单、合成速度快、反应过程绿色无污染。

2.1 微生物合成纳米硒

微生物制备纳米硒[28]，利用微生物（细菌、真菌、放线菌等）生长发育过程中的产物和硒盐反应制备纳米硒，该方法反应条件温和，制备的纳米硒生物活性高、尺寸较小、粒径均匀，稳定性强且环境友好。微生物绿色合成纳米硒，目前是合成纳米硒领域的热点，国内外有大量研究者在寻找不同种类的微生物来制备纳米硒，希望找到更适合的微生物种类来合成纳米硒。

Cremonini等[29]研究利用Bacillus mycoidesSeITE01还原亚硒酸盐，制备了粒径约为160 nm的纳米硒。武童等[30]研究大肠杆菌MG1655和亚硒酸钠反应，制备粒径了范围100 ～250 nm的纳米硒。周驰[31]利用生防菌枯草芽孢杆菌和亚硒酸钠溶液反应，制备了粒径范围50 ～250 nm的纳米硒。王丽红[32]研究嗜酸乳杆菌LA5和亚硒酸钠反应制备粒径范围80 ～150 nm的纳米硒。以上均属于细菌和硒盐反应制备纳米硒，目前国内外报道能制备纳米硒的细菌种类，包括Bacillus cereusCC-1[33]、贪铜杆菌[34]、Proteus mirabilisYC801[35]、淀粉芽孢杆菌[36]、Pseudomonasaeruginosa[37]、Pantoeaagglomerans[38]、Agrobacteriumsp[39]、Bacillussp.MSh-1[40]、Acinetobactersp.sW30[41]和植物乳杆菌[42]等，粒径范围在30 ～300 nm，且制备的纳米硒，粒径小，无细胞毒性，稳定性强，生物活性高。同时有研究发现，真菌和硒盐反应可以制备纳米硒，目前报道能制备纳米硒的真菌有Saccharomyces cerevisiae[43]、Aspergillus terreus[44]、酵母[45]等，不同真菌合成的纳米硒粒径大小不同。一些学者发现，放线菌也可制备纳米硒，且制备纳米硒的能力较强，目前报道的能制备纳米硒的放线菌有Streptomyces bikiniensisstrain[46]、StreptomycesmicroflavusstrainFSHJ31[47]和filamentous bacterium Streptomycessp.ES2[48]，粒径范围在17 ～500 nm，目前研究中使用放线菌制备纳米硒的研究者较少。Cui等[49]使用Tetrahymena thermophilaSB210合成了粒径范围50 ～500 nm纳米硒，是首个采用原生动物合成纳米硒的人，具有珍贵的研究价值。

不同微生物合成纳米硒粒径大小不同，反应时间不同，反应物种类不同，但反应条件都很温和，合成的纳米硒颗粒较为稳定，生物活性都很高，均无细胞毒性，都能够绿色高效制备纳米硒。微生物合成纳米硒总结详见表2。

表2 微生物合成纳米硒总结

2.2 植物提取物合成纳米硒

植物提取物合成纳米硒，一般采用植物提取物中有效成分（多糖、蛋白质、维生素C等）作为还原剂、分散剂或稳定剂等，利用植物提取物中有效成分和硒盐反应制备纳米硒。研究表明，植物提取物合成的纳米硒粒径小、稳定性强、无细胞毒性、环境友好。目前，许多植物提取物已被应用于制备纳米硒的研究中。

Mty等[50]利用龙蒿提取物和亚硒酸钠反应，合成了粒径范围20 ～50 nm的球状纳米硒。Ku等[51]从印度楝提取物制备球状纳米硒。穆静静等[52]从茶叶中提取粗多糖，以茶多糖为模板，制备粒径为75 nm纳米硒。崔东晓[53]利用昆布多糖作为稳定剂，利用抗坏血酸和亚硒酸钠反应，合成了粒径60 nm的昆布多糖纳米硒。高义霞等[54]使用刺槐豆多糖作为分散剂，利用亚硒酸钠和抗坏血酸，制备粒径范围95 ～100 nm的纳米硒。目前国内外报道的能用来制备纳米硒的植物提取物种类有壳聚糖[55]、Lemon(Citrus)plant[56]、Emblica officinalis[57]、Fenugreek[58]、柠檬[59]、Psidium guajava[60]、Diospyros montana[61]、Vitis vinifera[62]、Theobroma cacaoL.Bean ShellExtract[63]、Green tea[64]、紫菀叶提取物[65]、Hawthorn fruitextract[66]等，合成的纳米硒粒径范围为15 ～500 nm，生物活性高且稳定性强，有利于后期的开发利用。

植物提取物合成纳米硒，不同植物提取物制备的纳米硒粒径不同，最佳反应时间不同，最佳反应浓度不同，最佳反应温度也不同，但其反应条件都较为温和，反应时间短，生物活性高且无细胞毒性，都能绿色合成纳米硒。植物提取物合成纳米硒总结详见表3。

表3 植物提取物合成纳米硒总结

3 纳米硒的表征方法

生物法制备纳米硒的常见表征方法包括透射电子显微镜(TEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、能量色散X射线光谱(EDX)、紫外可见光谱(UV-vis)和动态光散射(DLS)。

3.1 透射电子显微镜(TEM)

TEM主要用于观察形貌和尺寸。在研究制备纳米硒的过程中，常常使用TEM观察合成纳米硒粒径大小和表面形态。

Mty A等[50]利用龙蒿提取物和亚硒酸钠反应，制备纳米硒，通过TEM观察到粒径范围20 ～50 nm纳米硒颗粒。Gunti等[57]报道合成了粒径15 ～40 nm的球状纳米硒。Mellinas等[63]通过TEM分析可可豆提取物合成了粒径范围在50 ～500 nm的纳米硒。Ye等[64]利用TEM观察到绿茶合成的粒径334.7 nm的球形纳米硒。Cui等[66]报道合成113 nm的球状纳米硒。王丽红等[67]研究植物乳杆菌LP21合成平均尺寸184.6 nm的纳米硒，合成了分散在胞外的球形颗粒，少量在胞内。张榕[68]的研究中核桃蛋白酶解物制备的纳米硒分散性好，形貌均匀，粒径小于50 nm。Forootanfar等[69]合成粒径范围在80 ～200 nm的纳米硒。综上所述，TEM是最常见的表征纳米硒的手段之一，可以让研究者更清晰直观的了解到纳米硒的粒径和形貌。

3.2 傅里叶红外光谱(FTIR)

在表征纳米硒的文献中，FTIR技术主要用于探测样品的官能团，测定其化学结构，来确定是否合成纳米硒，以及合成纳米硒的方式。

Mty A等[50]利用龙蒿提取物和亚硒酸钠反应，发现提取物中的酚类和蛋白质起稳定剂作用。苏文等[59]利用柠檬提取液合成的纳米硒FTIR光谱图，表明在合成纳米硒的过程中，柠檬提取液中酰胺基团、氨基等起还原、分散和保护的作用。王丽红等[67]研究植物乳杆菌LP21绿色合成纳米硒，纳米硒在3435(N-H、O-H)，2920(CH2、CH3)，1645(C=O)，1378(C-O 或C-H)，1046(C－O)有伸缩振动及669(C-H)处有外弯曲振动，纳米硒表面结合了蛋白质、多糖等有机物，起到稳定剂的作用。以上研究表明，生物大分子在纳米硒合成中起着重要作用。

3.3 X射线衍射(XRD)

XRD技术常应用于研究合成材料的晶体结构，在表征纳米硒的文献中，主要运用于研究合成的纳米硒是晶体还是无定型。

王丽红等[32]研究发现嗜酸乳杆菌转化合成的纳米硒是无定形的非晶态。MtyA等[50]利用龙蒿提取物和亚硒酸钠反应，制备晶体结构的纳米硒。高义霞等[54]研究发现刺槐豆多糖和亚硒酸钠反应合成的纳米硒是非晶态无定型的粉末。Gunti等[57]报道合成了无定型的纳米硒。苏文等[59]研究柠檬提取液和纳米硒的XRD图谱，结果表明合成的纳米硒粒径小、非晶态。王丽红等[67]研究的植物乳杆菌合成的纳米硒，结晶度差且无定形态。杨安源等[70]研究发现由海藻酸钠制备的纳米硒，为非晶态。Wang等[71]，Baskar等[72]，Sarkar等[73]和Qiu等[74]均发现合成的纳米硒为非晶态或晶态。以上研究均表明，生物法合成的纳米硒大多数是无定型，通过XRD技术，可以让研究者们快速确定合成的纳米硒形态，这一特性便于后期的应用研究。

3.4 能量色散X射线光谱(EDX)

EDX这一高新技术可用来分析样品中的元素组成和元素的含量。在生物法合成纳米硒的文献中，通常EDX和TEM结合使用，可以对样品进行微量元素成分分析及元素含量分析。

崔东晓[53]研究昆布多糖制备纳米硒，元素分析的结果表明，纳米粒子中硒的比例为23.4%，其他元素的占比分别为C(57.1%)、O(15.3%)、Na(2.62%)等。Gunti等[57]报道了合成的纳米硒的元素分析发现，元素种类占比为 Se(61.60%)、C(29.96%)、O(4.41%)等。Kokila等[61]合成的纳米硒元素含有Se(94.44%)、O(5.56%)等元素。Cui等[66]报道合成的纳米硒样品中，包括Se(25.6%)、C(24.1%)、O(35.6%)、Na(11.8%)等元素。张榕[68]的研究中核桃蛋白酶解物合成的纳米硒，C、O、P、Se元素总量达到94.70%，表明硒与核桃蛋白酶解物形成了纳米硒复合物。Menon等[75]合成的纳米硒中，研究发现含有Se、C、N、O等元素。综上所述，通过EDX技术能快速确定制备的产物中的元素成分，进一步验证是否合成纳米硒。

3.5 紫外可见吸收光谱(UV-vis)

在研究合成纳米硒的表征中，常用紫外可见分光光度计在200 ～750 nm范围内进行光谱扫射，表征合成纳米硒粒径大小。

Gunti等[57]报道了合成纳米硒在270 nm处有最大吸收峰值，合成1种粒径的纳米硒。苏文等[59]以柠檬提取液为原料合成纳米硒，借助UV-Vis技术观测纳米硒，在387 nm处有明显的吸收峰，吸收峰较宽，对称性较差，表征得到了类球形的纳米硒颗粒。Kokila等[61]以山药叶提取物为原料，观察最大峰值为261 nm。Mellinas等[63]报道了合成的纳米硒在236 nm和251 nm处显现2个吸收峰值，表示形成了2种尺寸的纳米硒粒子。Anu等[76]从大蒜中绿色合成了纳米硒，并注意到了紫外可见光最大值为260 nm。同样，Fesharaki等[77]也在218 nm和248 nm处观察到2种尺寸的纳米硒。Shah等[78]观察到270 nm处合成1种尺寸的纳米硒。综上，可见紫外可见光谱操作简单，可快速确定是否合成了纳米硒，推测合成纳米硒的尺寸大小。

3.6 动态光散射(DLS)

DLS技术可测量粒径和Zeta电位，是纳米科技中一种比较常规的表征方法。

穆静静等[52]以茶多糖为模板制备纳米硒，得到Zeta电位-53 mV。崔东晓[53]的研究中昆布多糖制备纳米硒电位为-25 mV。Gunti等[57]报道了合成Zeta电位-24.4 mV纳米硒。Mellinas等[63]合成的纳米硒的Zeta电位为(-28.60±5.3)mV。Ye等[64]报道绿茶合成绿茶纳米硒的电位为-41.5 mV。Cui等[66]获得的平均Zeta电位值为-23.2 mV。张榕[68]的研究中核桃蛋白酶解物合成的核桃蛋白酶解物纳米硒的Zeta电位值为-27.35 mV，可稳定保存。Menon等[75]报告从生姜提取物提取的纳米粒子的Zeta电位为-36 mV。Luesakul等[79]得到Zeta电位14.1 mV的纳米粒子。Zeta电位的绝对值的大小可以快速确定合成的纳米硒颗粒的稳定性，并且绝对值越高，体系越稳定，越不易聚集。因此，通过DLS技术，可以验证合成纳米硒对的稳定性，方便后期的开发利用。

4 纳米硒应用前景

生物法合成的纳米硒，主要应用在植物补硒、动物补硒和药物应用等方面。植物补硒，主要目的是提高硒含量、抗病虫害、增加产量和提升品质。动物补硒，主要目的是提高免疫力、提高繁殖能力和提升肉类品质。药物应用，主要是制备抗癌药、抗肿瘤药、补硒药等。

4.1 植物补硒

植物补硒主要采用溶液喷洒法或固体培土法。首先，制备纳米硒。其次，将制备的纳米硒溶液或纳米硒固体，按一定比例添加进药物喷洒或植物肥料中吸收。最后，对收获的植物进行测试验收。一般情况下，植物补硒，硒含量能增加3 ～5倍，促进生长，增强抗病毒能力，风味更佳，还可以用于果蔬保鲜。

Hussein等[80]给花生喷洒了纳米硒溶液，结果表明，喷洒纳米硒，可以提高种子中的含硒量，且对人体健康无害。Antony等[81]给Macrotyloma uniflorum种子喷洒纳米硒，研究发现可以增强种子的生命力。刘嘉伟等[82]使用纳米硒，用于植物灰霉病的防治，结果表明，纳米硒对存在于蔬菜、水果及花卉等多种植物的植物灰霉病有较好的防治作用。肖锡湘[83]以不产氧光合细菌(Rhodobacter sphaeroidesYL75)制备生物源纳米硒，应用于食品包装材料，用于果蔬保鲜。朱磊[84]研究纳米硒对中药材金荞麦(Fagopyrum dibotrys)的富硒能力，发现适度的纳米硒，对植物生长有益，提高代谢能力。胡万行等[85]研究表明，给紫色马铃薯叶面喷洒纳米硒溶液，能够提高含硒量，促进生长，增加结果量，提高马铃薯的品质。

4.2 动物补硒

动物补硒，主要是在饲料中添加纳米硒。作为添加剂，纳米硒粒径小，生物活性高，无毒无害，吸收率高，能增强动物免疫力、保育能力、抗氧化能力以及提高生长速度。动物在生长发育过程中产生的自由基团，对胚胎有害，减弱精子的活性，影响繁殖能力。动物补硒，硒可清除自由基以提高雄性动物精子活力，同时可改善雌性动物的繁殖能力，从而提高动物的繁殖能力。随着中国养殖业的迅速发展，纳米硒，作为一种新型补硒添加剂，应用于饲料的需求不断增加，未来有望逐渐形成规模化产业。

陈惠婷等[86]在肉鸡饲料中添加纳米硒，提高了肉鸡的免疫能力，同时促进了肉鸡的生长发育还降低料重比，能增加经济效益。戴五洲[87]在猪饲料中添加纳米硒，饲料中补充纳米硒能促进生长、增强免疫力、增加含硒量以及改善猪肉品质。李若铭等[88]在水产动物中补硒，能促进生长和预防疾病。江淼[89]研究报道，饲料中添加纳米硒，可以提高雄性动物精子活力，而且可改善雌性动物的繁殖能力。

4.3 药物开发

纳米硒尺寸极小，便于人体吸收利用，且具有抗菌性、抗氧化性、抗病毒性、抗肿瘤活性和强抗癌性，可以用于人体补硒，制备抗癌药，抗肿瘤药，甚至是用于美妆。

目前，陈琬雯等[55]制备壳聚糖纳米硒，可以诱导肿瘤细胞凋亡，具有良好的抗肿瘤活性。苏华华等[90]研究发现纳米硒，具有强抗癌活性，是一种很有前途的抗癌药。张泽杭[91]研究发现纳米硒可调节细胞内的氧化应激水平，来治疗糖尿病。Liza[92]的研究纳米硒能通过促进非小细胞肺癌自噬作用，进而达到抑制恶性肿瘤的作用，可用于制备抗肿瘤药。

5 结语与展望

近年来，随着生活水平的提高，富硒食品，因其具有增强人体免疫力、清除体内自由基、防癌抗辐射、美容养颜和免疫调节的功能，深受消费者喜爱，目前市场上的富硒食品远远无法满足消费者的需要，大量研究者开始研究纳米硒的合成方法。

目前合成纳米硒的3种方法，由于物理法和化学法合成纳米硒的代价昂贵，成本高，耗时长，污染环境。生物法的反应条件温和，稳定性强，对环境友好，已成为制备纳米硒的新趋势，是目前最热门的新兴领域，具有广阔的应用前景。

未来纳米硒应用前景可聚焦于动物补硒、植物补硒和药物应用等方面。尽管纳米硒展现出良好的应用前景，但仍面临诸多挑战，例如，生物法合成的纳米硒，如何从实验室进入工业化生产是一大难题，纳米硒应用于动植物体时，在机体内发生怎样的生化反应是另一大难点。目前，市面上纳米硒的产品种类远远无法满足消费者的需要，有关纳米硒的合成方法和应用开发有待学者们继续深入研究，为纳米硒在各个行业的应用提供扎实的科技理论支撑。